إعداد أنسجة عضلة القلب البشرية للزراعة على المدى الطويل
Summary
نقدم بروتوكولا لزراعة أنسجة عضلة القلب البطينية البشرية خارج الجسم الحي. يسمح بإجراء تحليل مفصل لقوة الانكماش والحركيات ، بالإضافة إلى تطبيق الحمل المسبق واللاحق لمحاكاة البيئة الفسيولوجية في الجسم الحي عن كثب.
Abstract
شهدت زراعة الخلايا العضلية القلبية عددا كبيرا من التطورات ، بدءا من زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) إلى المواد العضوية المشتقة من iPSC. في عام 2019 ، تم عرض طريقة خارج الجسم الحي لزراعة شرائح عضلة القلب التي تم الحصول عليها من عينات القلب البشري ، بينما تقترب في حالة الجسم الحي من تقلص عضلة القلب. تنشأ هذه العينات في الغالب من عمليات زرع القلب أو مواضع أجهزة مساعدة البطين الأيسر. باستخدام اهتزاز ونظام زراعة مطور خصيصا ، يتم وضع شرائح بسماكة 300 ميكرومتر بين سلك ثابت وسلك زنبركي ، مما يسمح بزراعة مستقرة وقابلة للتكرار لعدة أسابيع. أثناء الزراعة ، يتم تحفيز الشرائح باستمرار وفقا للإعدادات الفردية. يمكن عرض الانقباضات وتسجيلها في الوقت الفعلي ، ويمكن تطبيق العوامل الدوائية بسهولة. يمكن جدولة بروتوكولات التحفيز المحددة من قبل المستخدم وتنفيذها لتقييم معلمات الانكماش الحيوية مثل تقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعتبة التحفيز ، وعلاقة تردد القوة ، وفترة الحراريات. علاوة على ذلك ، يتيح النظام إعدادا متغيرا قبل وبعد الحمل لزراعة أكثر فسيولوجية.
هنا ، نقدم دليلا خطوة بخطوة حول كيفية توليد زراعة ناجحة على المدى الطويل لشرائح عضلة القلب البطينية اليسرى البشرية ، باستخدام حل زراعة محاكاة حيوية تجاري.
Introduction
في العقد الماضي ، حققت زراعة خلايا عضلة القلب في المختبر تقدما كبيرا ، بدءا من تقنيات ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد (3D) إلى استخدام المواد العضوية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المتمايزة في الخلايا العضلية القلبية1،2،3. وقد أظهرت زراعة الخلايا خارج الجسم الحي والخلايا الأولية أنها ذات قيمة كبيرة ، خاصة بالنسبة للدراسات الجينية وتطوير الأدوية4،5،6. استخدام الأنسجة البشرية يحسن القيمة الانتقالية للنتائج. زراعة 3D على المدى الطويل من أنسجة عضلة القلب مع الهندسة سليمة، ومع ذلك، ليست راسخة بشكل جيد. الهندسة السليمة هي ميزة رئيسية لمحاكاة في ظروف الجسم الحي ، حيث أن وظيفة القلب المناسبة ، والتواصل بين الخلايا المختلفة ، وكذلك تفاعلات مصفوفة الخلايا هي شروط أساسية. مرت زراعة أنسجة عضلة القلب بمراحل مختلفة من التطور. كان معدل نجاح واستقرار زراعة أنسجة عضلة القلب خارج الجسم الحي منخفضا جدا في البداية ، لكن الأساليب الحديثة أسفرت عن نتائج واعدة7،8،9،10،11.
من بين هؤلاء ، كان فيشر وآخرون أول من أثبت أن الجدوى والأداء الانقباضي لأنسجة عضلة القلب البشرية يمكن الحفاظ عليها في زراعة الخلايا خارج الجسم الحي لعدة أسابيع7. استندت تقنيتهم إلى شرائح الأنسجة الرقيقة المقطوعة من عضلة القلب البشرية المزروعة ، والتي تم تركيبها في غرف زراعة مطورة حديثا توفر ظروفا ميكانيكية حيوية محددة وتحفيزا كهربائيا مستمرا. تشبه طريقة الزراعة هذه إلى حد كبير وظيفة أنسجة عضلة القلب في الجسم الحي ، وقد تم استنساخها من قبل العديد من مجموعات البحث المستقلة2،12،13،14،15. والأهم من ذلك، أن الغرف التي استخدمها فيشر وآخرون مكنت أيضا من التسجيل المستمر للقوى المتقدمة لمدة تصل إلى 4 أشهر، وبالتالي فتحت فرصا غير مسبوقة للبحوث الفسيولوجية والدوائية على عضلة القلب البشرية 7 السليمة.
تم تطوير تقنيات مماثلة بشكل مستقل من قبل مجموعات أخرى وتطبيقها على عضلة القلب البشرية والفئران والخنازير والأرانب7،10،11. طور بيتوليس وآخرون لاحقا طريقة أكثر فسيولوجية ، والتي تعيد إنتاج العلاقة الطبيعية بين القوة والطول خلال دورة الانكماش ، ولكنها أقل ملاءمة للتحليل عالي الإنتاجية16. على هذا النحو ، يمكن اعتبار النهج العام للزراعة المحاكاة الحيوية خطوة أخرى في الحد من التجارب على الحيوانات وصقلها واستبدالها (3R).
ومع ذلك، فإن استغلال هذه الإمكانات يتطلب إجراءات موحدة، وتحليلات عالية المحتوى، ومستوى إنتاجية مرتفعا. نحن نقدم تقنية تجمع بين التقطيع الآلي لعضلة القلب البشرية الحية مع الصيانة في المختبر في نظام زراعة المحاكاة الحيوية الذي أصبح متاحا تجاريا (انظر جدول المواد). مع النهج المقترح ، فإن عدد الشرائح الفردية التي يمكن إنشاؤها من عينة عضلة القلب عبر الجدارية واحد محدود فقط بوقت المعالجة. غالبا ما تنتج عينة ذات حجم وجودة كافيين (3 سم × 3 سم) 20-40 شريحة أنسجة يتم قطعها بسهولة باستخدام اهتزاز آلي. يمكن وضع هذه الشرائح في غرف الزراعة التابعة للنظام. تسمح الغرف بالتحفيز الكهربائي ، الذي يمكن تعديل معلماته (أي مدة النبض ، والقطبية ، والمعدل ، والتيار) ، بالإضافة إلى ضبط الحمل المسبق واللاحق ، باستخدام أسلاك زنبركية داخل الغرف. يتم تسجيل تقلص كل شريحة من حركة مغناطيس صغير متصل بسلك زنبركي ويتم عرضه كرسم بياني قابل للتفسير. يمكن تسجيل البيانات في جميع الأوقات وتحليلها باستخدام البرامج المتاحة مجانا. بصرف النظر عن وتيرة خط الأساس الثابتة ، يمكن تنفيذ البروتوكولات المجدولة لتقييم فترة المقاومة للحرارة وظيفيا ، وعتبة التحفيز ، وتقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعلاقة تردد القوة.
هذه الزراعة المحاكاة الحيوية طويلة الأجل لشرائح عضلة القلب المتعددة من قلب فردي تمهد الطريق للبحوث المستقبلية خارج الجسم الحي في كل من الأنسجة البشرية والحيوانية ، وتسهل فحص الآثار الدوائية العلاجية والسامة للقلب في طب القلب والأوعية الدموية. وقد تم تطبيقه بالفعل على مختلف الأساليب التجريبية2،12،13،15. هنا ، نقدم وصفا مفصلا خطوة بخطوة لإعداد الأنسجة البشرية ونقدم حلولا لمشاكل الزراعة التي تواجهها بشكل متكرر.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الماضي ، حققت أبحاث القلب والأوعية الدموية تقدما كبيرا في زراعة الخلايا العضلية القلبية. ومع ذلك ، فإن زراعة 3D من الخلايا العضلية القلبية مع الهندسة السليمة ليست راسخة بعد. بالمقارنة مع البروتوكولات السابقة المطبقة على زراعة أنسجة عضلة القلب خارج الجسم الحي ، فإن البروتوكول الذي ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل البحث من خلال منح DZHK 81Z0600207 (JH و PS و DM) و 81X2600253 (AD و TS).
يود المؤلفون أن يشكروا كلوديا فاهني ومي بينغ وو وماتياس سيميش على دعمهم في إعداد الإعدادات، وكذلك على الصيانة المنتظمة لزراعة الأنسجة.
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish bioreactor system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
Riferimenti
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -. O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
