Summary
原子間力顕微鏡を使用して、正常および病気の肝臓のコラーゲンが豊富な領域の弾性率を測定するためのプロトコルを提示します。偏光顕微鏡を同時に使用することで、肝臓切片のコラーゲンが豊富な領域を特定するための高い空間精度が得られます。
Abstract
マトリックスの硬化は、肝線維症の進行の主要な推進力の1つとして認識されています。細胞機能、分化、運動性など、細胞の挙動のさまざまな側面に大きな影響を与えます。しかし、これらの過程は臓器全体で均一ではないため、組織の機械的性質の変化を細胞レベルで理解することがますます重要になっています。
肝葉内のコラーゲンが豊富な領域の硬化を監視できるようにするために、この論文は、原子間力顕微鏡(AFM)によって高い空間精度で肝臓組織の弾性率を測定するためのプロトコルを提示します。AFMは、ヤング率(弾性率とも呼ばれる)として計算される局所的な機械的特性を特徴付ける可能性のある高感度な方法です。偏光顕微鏡と組み合わせたAFMを使用して、組織内のコラーゲン線維の複屈折に基づいて線維症の発生領域を特異的に特定できます。提示されたプロトコルを使用して、線維性マウス肝臓からのコラーゲンリッチ領域と対照マウスの肝臓の対応する領域の剛性を特徴付けました。
コラーゲン陽性領域の剛性の顕著な増加は、線維症の発症とともに観察されました。提示されたプロトコルは、穏やかに固定された肝臓組織の使用により、再現性の高いAFM測定方法を可能にし、局所組織の機械的特性における疾患による変化と隣接細胞の運命への影響の理解を深めるために使用できます。
Introduction
肝臓は、生物の恒常性を維持するための重要な器官です1,2。慢性肝疾患は、世界中で年間200万人~200万人の死亡を占めています3。それらは、ウイルス感染症、自己免疫疾患、メタボリックシンドローム、またはアルコール乱用関連疾患として最も一般的に発生し、進行性の肝線維症を伴います。肝障害は炎症反応を誘発し、創傷治癒応答において細胞外マトリックス(ECM)を沈着させる細胞の活性化をもたらす。しかし、慢性的な侮辱の存在下では、過剰なECMが肝臓内に未解決の瘢痕組織を形成し、肝線維症、肝硬変、肝癌、そして最終的には肝不全の発症につながります4。
肝細胞損傷は直ちに肝硬直の増加をもたらす5,6。これは肝細胞機能に直接影響を及ぼし、肝星細胞(HSC)と門脈線維芽細胞を活性化し、コラーゲン沈着筋線維芽細胞への分化形質転換をもたらします7,8。線維性ECMの沈着は肝臓の硬さをさらに高め、肝臓の硬化とマトリックス産生細胞の活性化の自己増幅フィードバックループを作り出します。
したがって、肝硬直は肝疾患の予後において重要なパラメータとなっています。生体力学的組織特性の変化は、組織学的分析によって線維症を診断できるよりも早く検出することができる。そのため、肝臓のこわばり測定のための様々な技術が、研究と臨床応用の両方において開発されてきた。臨床現場では、一過性エラストグラフィ(TE)9,10,11,12,13および磁気共鳴エラストグラフィ(MRE)14,15,16,17,18が、肉眼的肝硬直を調べることにより、肝障害の初期段階を非侵襲的に診断するために採用されています19。
TEでは、穏やかな振幅と低周波(50 Hz)の超音波が肝臓を伝播し、それらの速度を測定し、それを使用して組織弾性率を計算します13。しかしながら、この技術は、肝臓9の周囲の組織を通る超音波の不適切な伝達のために、腹水、肥満、または下部肋間腔を有する患者には有用ではない。
MREは磁気共鳴画像法に基づいており、20〜200Hzの機械的横波を使用して肝臓を標的にします。次に、特定の磁気共鳴画像シーケンスを使用して、組織内の波を追跡し、組織の剛性を計算します16。TEおよびMRE技術の両方で報告された剛性値は、組織学的METAVIRスコア20を使用してランク付けされたヒト肝臓サンプルの生検から得られた肝線維症の程度とよく相関しています(表1)。TEとMREは、研究目的でげっ歯類モデルの肝臓の硬さの測定にも適合しています21、22、23。ただし、どちらの方法でも、伝播する横波に対する組織の応答から剛性値が導出されるため、得られた値は組織の絶対的な機械的剛性を反映していない可能性があります。
げっ歯類の肝臓の直接的な機械的特徴付けのために、Barnesらは、ポリアクリルアミドゲル24への肝臓組織の埋め込みを含むモデルゲル組織アッセイ(MGTアッセイ)を開発しました。このゲルはパルス状の均一な力によって圧縮され、そこからヤング率を計算することができます。MGTアッセイは、正常および線維性肝臓の両方に適合したインデンテーションアッセイと良好な相関を示す24 (表1)。
表1:バルクレベルでの肝臓のこわばり値。 TE および MRE を、異なるソースからの肝臓のインデンテーションおよび MGT アッセイを使用した肝臓弾性率の直接的なex vivo機械的測定と比較しました。E と G の関係は E = 2G (1 + v) で与えられ、v はサンプルのポアソン比です。F0からF4はMETAVIRスコアリングシステムの線維症スコアを表し、F0は線維症が低いかまったくないか、F4肝硬変を示します。略語:TE =過渡エラストグラフィー;MRE =磁気共鳴エラストグラフィー;MGT =モデルゲル組織;E =弾性(ヤング)弾性率。G =せん断弾性率。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
一般的な肝臓のこわばり測定の主な欠点の1つは、肝臓の硬さの不均一性の細胞レベルの分解能を提供しないことです。線維症の進行中、コラーゲンが豊富な領域は周囲の実質と比較してより高い剛性を示す25,26。この剛性勾配は、常在細胞に局所的に影響を及ぼし、HSCの不均一性を駆動する上で重要な役割を果たします27。したがって、肝疾患の発症中の局所的な機械的特性の変化は、線維症の進行をよりよく理解するために顕微鏡レベルで特徴付ける必要があります。
AFMにより、組織の機械的特性を高解像度と高力感度で測定できます。AFMは、カンチレバーの先端を使用して、数ピコニュートンという低い力でサンプルの表面をくぼみ、使用する先端の形状とサイズに基づいて微視的またはナノスコピックレベルで変形を誘発します。加えられたひずみに対するサンプルの力応答は、次にカンチレバー28のたわみとして測定されます。力−変位曲線は、カンチレバーの接近および後退から収集され、これは、試料29の局所剛性を評価するために適切な接触力学モデルと適合させることができる。
AFMは、所与の領域の剛性を測定することに加えて、コラーゲン繊維の構造など、サンプル中の特定の特徴に関するトポグラフィー情報も提供することができる30、31、32。複数の研究により、患者およびマウスモデルサンプルの両方から、皮膚32、33、肺34、35、脳36、乳腺37、38、39、軟骨40、または心臓41、42、43、44などのさまざまな健康組織および疾患組織の硬さを測定するためのAFMの適用が記載されている。さらに、AFMは、細胞および細胞外タンパク質足場の剛性を決定するためにインビトロでも使用されている45、46、47。
AFMを使用した生物学的サンプルの機械的特性の測定は、その柔らかさと脆弱性のために自明ではありません。したがって、さまざまな研究がさまざまな条件と設定を標準化しており、ヤング率の値が大きく変動しています(Mckeeらによるレビュー48)。他の軟部組織と同様に、異なるグレードの肝線維症における肝ヤング率値も広範な変動を示す(表2)。ヤング率値の違いは、AFMの動作モード、カンチレバーチップ、サンプル調製方法、サンプルの厚さ、くぼみの深さと力、測定中の肝臓組織環境、および分析方法の違いから生じます(表2)。
表2:細胞レベルでの肝臓のこわばり値。 AFMを使用して得られた肝臓のこわばり値は、細胞レベルでの肝臓の機械的特性を表します。略語:AFM =原子間力顕微鏡;E =弾性(ヤング)弾性率。PFA = パラホルムアルデヒド;PBS =リン酸緩衝生理食塩水。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
この論文では、偏光顕微鏡を使用して提供される正確な局在化を使用して、AFMによる肝臓組織のコラーゲンに富む線維性領域のヤング率の再現可能な測定のためのプロトコルについて説明します。四塩化炭素(CCl4)を投与して、マウスモデルにおいて小葉中心様式でコラーゲン沈着を誘導し49、ヒト肝線維症の重要な側面を確実に模倣した50。偏光顕微鏡画像は、コラーゲン線維51の複屈折による肝臓におけるコラーゲンの可視化を可能にし、これにより、肝小葉52内の所望の関心領域上でカンチレバー先端を正確に位置決めすることができる。
Protocol
すべての動物実験は、分子遺伝学研究所の動物管理委員会によって承認された動物プロトコルおよび動物実験に関するEU指令2010/63 / EUに従って実施されました。提示されたプロトコルの全体概略図を 図1に示します。
図1:マウス肝臓からのヤング率のAFM評価の全体概略図。 (A)対照マウスまたは処置マウスからの肝臓の単離、それに続く切片作成および−80°Cでの貯蔵(最大保存、2週間)。(B)球状ビーズをカンチレバーに取り付け、その後接着剤を一晩硬化させる(左)。カンチレバーキャリブレーションとそれに続くサンプルマウント(右)。(C)明るいコラーゲン構造を視覚化するための偏光子と分析器の位置合わせに続いて、AFMカンチレバーの下の測定フィールドとカメラ内の画像のオーバーレイ。(D)剛性マップの取得と解析。略語:AFM =原子間力顕微鏡;PBS =リン酸緩衝生理食塩水;OCT = 最適な切削温度コンパウンド;CCl4 =四塩化炭素。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
1. サンプル調製 I
- 麻酔下で頸部脱臼によって安楽死させたマウスの開いた腹部から肝臓を切除する。左外側ローブを分離し、ドライアイスで急速凍結することにより、ローブの外側半分を最適な切断温度(OCT)コンパウンドに埋め込みます。OCT包埋組織は-80°Cで保存してください。
注:以前の研究では、凍結組織と新鮮組織の間で剛性値が類似していることが示されています25,26。 - 厚さ30 μmの肝臓切片をクライオトームを使用して正に帯電したスライドに切断し、AFM測定の日までスライドを-80°Cで2週間以内に保管します。
2.機器のセットアップ
- AFMカンチレバーチップへの5.7 μmビーズの取り付け(補足図S1、ステップ1〜5)
注:カンチレバーへのビーズの取り付けは、Norman et al.46によって以前にも説明されています。- 直径5.7 μmのメラミン樹脂ビーズの懸濁液をスライドガラスの半分の領域に均等に広げ、風乾して溶媒を蒸発させます(補足図S1、ステップ1)。
- スライドの残りの半分に、10 μLのチップを使用して、作業時間の長いプレミックスエポキシ樹脂の細い線を作成します(補足図S1、ステップ1)。
- 製造元の指示に従って、カンチレバープローブをAFMヘッドにロードします。
- カンチレバープローブを取り付けたAFMヘッドでスライドとカバーを取り付けます。
注:SD-qp-BioT-TL-10カンチレバーが研究に使用されました。 - プレミックスされたエポキシ樹脂接着剤をスライドの中央に持ってきて、低力でカンチレバーで接着剤に近づきます(このプロトコルに従うには、設定値を1 Vに設定します。補足図S1、ステップ2)。
注意: スライド面に近づく前に、セクション6、パート8、AFMカンチレバーのスプリング定数のキャリブレーションの手順2〜3に従って、レーザーがカンチレバーの先端の中央に位置合わせされていることを確認してください。 - カンチレバープローブの先端が接着剤と接触したら、スライドのすぐ上に移動して余分な接着剤を取り除きます。
- 次に、カンチレバーの先端をスライドから引っ込め、スライドを動かして、中央に1つのビーズを移動します(補足図S1、ステップ3)。より高い力(設定値2 V)でAFMカンチレバープローブを使用してビードに再度近づき、カンチレバープローブの中央にビーズを取り付け、少なくとも10秒間放置します(補足図S1、ステップ4)。
- カンチレバープローブを取り出し、室温で一晩保管して接着剤を硬化させるか、エポキシ樹脂の指示に従ってください(補足図S1、ステップ5)。
- 偏光子とアナライザーのセットアップ
- 肝臓切片内の関心領域を見つけるには、偏光子と分析装置を備えた顕微鏡をセットアップします。一方を他方に対して手動または自動化された方法で回転させることにより、振動方位角を互いに0°〜90°の角度に合わせ、透過光を最小限に抑え、対物レンズを通過する異常な光線を最大化します。偏光画像(図2)の暗い背景に対してコラーゲン線維が明るく見えることを確認し、画像ヒストグラムのピークが明るいピクセルにシフトすることによって反映されます。
図2:代表的な顕微鏡画像は、明視野画像と比較して、偏光顕微鏡におけるコラーゲン線維の顕著な視覚化を示しています。CCl4で3週間処置したマウスからの肝臓切片を、(A)明視野および(B)偏光顕微鏡に供した。複屈折コラーゲン線維は、明視野画像と比較して偏光画像で白くはっきりと見えます。赤いボックスは、AFM測定に使用されるコラーゲンが豊富な領域を表します。差し込み図は、赤いボックスにエリアの拡大ビューを表示します。スケールバー= 100μm。略語:AFM =原子間力顕微鏡;CCl4 =四塩化炭素;CV =中心静脈;PV =門脈。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
注:このプロトコルでは、AFMヘッドを任意の適切な倒立顕微鏡に取り付けることができ、偏光子と分析装置を挿入することができます。システムは、バックグラウンドノイズを低減するために絶縁ユニットに配置する必要があります。
- AFMカンチレバーのばね定数の校正
- 製造元の指示に従って、カンチレバープローブ(セクション1、パート2、AFMカンチレバーチップへの5.7μmビーズの取り付けの手順1〜8に従って準備)をAFMヘッドにロードします。
- 測定中のカンチレバーの汚染を防ぐために、70%エタノールでカンチレバーを清掃してください。蒸留水で広範囲に洗浄して、チップから残留エタノールを取り除きます。
- 接触モードを有効にし、測定方法としてフォースマッピングを選択します。
- 対応するボタンをクリックして、ソフトウェアタブで関連するすべてのウィンドウ(Zステッピングモーター、電動ステージコントロール、データビューア、フォーススキャンマップオシロスコープ、レーザーアライメント、カメラウィンドウ)を開きます。
- 1.2 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む清潔なスライドガラスを、疎水性マーカーペンで描かれた約2 cm x 4 cmの領域に取り付けます。AFMヘッドを顕微鏡ステージに取り付け、カンチレバーがPBSに完全に浸されていることを確認します。
- カンチレバーの先端に対物レンズを集中させます。顕微鏡の透過光の強度を下げて、モニター上のレーザー位置をよりよく表示します。
- レーザーをカンチレバーの半透明の端(球状ビーズが取り付けられている端)に向け、AFMヘッドのノブを使用してミラーの位置を合わせ、検出器のレーザービームの合計強度を最大化します( レーザーアライメント ウィンドウの合計で示されます)。
- AFMヘッドにあるノブを使用してフォトダイオード検出器の位置を合わせ、レーザーをその中心に配置します。
- キャリブレーションを続行する前に、カンチレバーを15分間安定させます。
- キャリブレーションマネージャを開き、カンチレバーのタイプ、カンチレバー寸法、環境条件を挿入します。[キャリブレーション]をクリックして、スプリング定数と感度(逆光学レバー感度、InvOLSとも呼ばれます)をキャリブレーションします。校正後に得られたばね定数の精度をメーカー宣言で確認してください。非接触モードでカンチレバーを校正します(校正は、Saderらによって導出された熱定理を使用してソフトウェアによって実行されます58)。
注:カンチレバーのバネ定数は、カンチレバーの剛性を表し、変形長さごとに変形するカンチレバーの抵抗力によってN / mで与えられます。カンチレバーの感度は、カンチレバーのたわみ(ナノメートル単位)に応じたフォトダイオード応答の値(ボルト単位)を表し、通常はnm/V59で表されます。非接触モードでは、熱ノイズスペクトルが記録され、校正後にAFM制御ソフトウェアによって流体力学的機能60 が自動的に取り付けられます。継ぎ手は、キャリブレーションパラメータ、つまりばね定数とInvOLSを提供します。この研究で使用したSD-qp-BioT-TL-10カンチレバーのバネ定数は、メーカーが宣言したように0.09 N / mでした。
3. サンプル調製 II
- 凍結切片(セクション1、サンプル調製Iに記載されているように-80°Cで保存)を室温で2分間解凍します。
- 氷冷した4%パラホルムアルデヒド(PFA)を1x PBSで4°Cで10分間固定した後、1x PBSで広範囲に洗浄(5x)します。切片の周りの残留PBSをティッシュで拭き取り、疎水性マーカーペンで肝臓切片の周囲約2 cm x 4 cmの境界に印を付けます。サンプルを1x PBSで覆います(境界領域に1x PBSが~1.2 mL含まれていることを確認してください)。AFM測定にはサンプルを使用してください。
注意: PFAは危険な化学物質であるため、皮膚や目との接触を防ぐために注意して取り扱う必要があります。有毒ガスを避けるために、PFAを含むすべての手順は、認定された化学ヒュームフードまたはその他の承認された換気エリアで実行する必要があります。
4. 測定
- 自動保存を有効にするには、[セットアップ]タブに移動し、[自動保存]にチェックマークを付けます。測定ファイルを保存するファイル名とディレクトリを指定するには、[設定]タブに移動し、[設定の保存]をクリックします。
- サンプルをロードします(セクション3、サンプル調製IIに従って調製)。 レーザー をオンにしてアプローチキーをクリックして、AFMカンチレバーで組織表面に アプローチ します。先端が組織表面に接触したら、先端が対物レンズの焦点に留まるように片持ち梁の先端を引っ込めます( リトラクション キーをクリックすると、カンチレバーがピエゾ範囲の上端に引っ込められます)。レーザー位置が レーザーアライメント ウィンドウの中心から離れている場合は、検出器を再調整します。
- レーザーをオフにし、顕微鏡の光学場をAFM測定マップにオーバーレイするには、[アクセサリ]タブをクリックし、[直接オーバーレイ光学キャリブレーション]を選択します。次のウィンドウで、[次へ]をクリックして、特定の領域をスキャンするカンチレバーの一連の画像を撮ります。もう一度[次へ]をクリックして、次のウィンドウに進みます。
- 最初の画像では、カンチレバーの先端の中央を手動でクリックして、ソフトウェアで先端の位置を示しています。先端位置を表す円は、精度 を高めるために半径を示す ことでサイズを操作できます。[ キャリブレーション]をクリックすると、すべての画像で片持ち梁の先端位置が自動的に検出されます。画像を見て、チップ検出の精度を確認します。
- [ 次へ ]、[ 完了] の順にクリックして光学オーバーレイを終了し、光学キャリブレーション中にキャプチャされた一連の画像を保存します。
- カンチレバーをさらに引っ込めて、スライド上のより高い表面との衝突を回避します。ステージを移動し、偏光画像を使用して[データビューア]タブに表示されている緑色のボックス内にコラーゲンが豊富な領域を配置します。コラーゲンが豊富な領域を選択し、指定した緑色のボックス内でマウスの左ボタンを長押しして、その周りに長方形を作成します。左側の[グリッド]タブで選択した領域の寸法、方向、解像度を定義します。[新しいスキャン領域の確認]をクリックして、選択した領域を測定領域として設定します。
- フィードバックループのIGainおよびPGainパラメータをデフォルト値に保ちます(システムの過敏性の形で大きな不安定性が現れない場合)。このプロトコルに従うには、IGain を 50 Hz、PGain を 0.001 に設定します。
- セットポイントを1nNに設定します。
注意: 設定値は、静止状態の間の先端と表面の相互作用の力です。ほとんどのソフトサンプル(細胞、ゲル、組織)では、0.5〜2.0 nNの範囲のセットポイント値が適切です。 - 調査対象の材料の機械的特性とカンチレバーの剛性に応じて、 相対設定値 を選択します。このプロトコルでは、値を 5 nN に設定します。
注意: 相対設定値は、力-距離曲線のピークに達し、先端の動きがベースラインに戻ったときの相互作用の最大力を表します。柔らかい材料(1〜50 kPa)の場合、このパラメーターはナノニュートン(nN)単位で設定されます。さらに、柔らかいカンチレバー(ばね定数が0.05 N / mから0.35 N / m)の場合、適用できる最大力は約50 nNです。 それに応じて 、セットポイント値と 相対セットポイント値 を調整します。- 与えられた設定値が球面圧子の半径よりも大きな押し込み深さにならないことを確認してください、さもなければインデント面はヤング率の計算で適切に定義できません。インデントの最初の実行後のインデント深さの平均値を計算します。記録されたデータの処理方法については、セクション5「データ分析」を参照してください。必要に応じて 設定値 を調整します。
- [ベースラインの調整] を 5 に設定します。
注:ここで、 ベースライン とは、アプローチ曲線とリトラクト曲線をフィッティングするために使用される多項式の次数を指します。ベースラインを5に設定すると、曲線が高解像度にフィットするため、測定中のバックグラウンドノイズを確実にキャプチャできます。 - サンプルの表面トポグラフィーに応じて、Z軸のカンチレバー移動の長さ(Z長さ)を選択します。このプロトコルに従うには、 Z長 を 15μmに設定します。
注:高い値( 15μmなど)は測定感度を低下させますが、通常、線維性肝臓組織などの非常に不規則な表面を持つサンプルに必要です。 - [Z 移動] を [一定時間] に設定します。
注意: Z 移動を 一定 速度に設定して、 Z移動 (速度の 延長と 時間の延長)を参照するデータを別のモードで表示することもできます。 - [延長時間] を 1 秒に設定します。延長遅延とリトラクション遅延を0に設定します。
注意: 非常に柔らかい材料61には、>5.0 μm / sの延長速度を使用してください。押し込み速度が低いと、柔らかい表面からの粘性が高く、弾性応答が低下するためです。 伸長 遅延および収縮遅延 は、カンチレバーチップと基板との間の特定の相互作用(例えば、カンチレバーの表面に固定化されたタンパク質とスライド表面に固定化されたタンパク質との相互作用)を研究するために使用できるパラメータです。 - サンプルレートを5000Hzに設定します。
注: サンプルレートは、完全なアプローチリトラクト曲線に記録されたポイントの頻度を指します。これを高い値( 5000 Hzなど)に設定して、非常に速い遷移のために曲線の特定の領域が欠落しないようにします。 - Zクローズドループをティックでマークしてフィードバックループシステムを有効にし、サンプル表面とカンチレバーチップの間の連続距離を確保します。
- 「エンゲージ」の選択を解除して電動ステージを解除し、「アプローチ」をクリックしてカンチレバーでサンプルに近づきます。[スキャンの開始]をクリックして、手順6で設定した領域で力と距離の曲線の収集を開始します。セクション4、測定。
5.データ分析
- 取得したデータをオープンソースソフトウェア「AtomicJ」(https://sourceforge.net/projects/jrobust/ からダウンロード可能)で解析します。
注:アジレントテクノロジー、JPKインスツルメンツ、またはブルカー原子間力顕微鏡から収集されたファイルをサポートしています。 - AtomicJのプロセス力曲線とマップアイコンをクリックして、 力曲線 をプログラムにロードします(補足図S2A、x)。 処理アシスタントで、[ 追加 ]ボタンをクリックして分析するマップを追加します(補足図S2A、y)。マップが読み込まれたら、[ 次へ ]をクリックします(補足図S2A、z)。
- 次のウィンドウで、以下に説明する手順( 補足図S2B、手順1〜11のステップに対応)に従って処理設定を指定します。
- サンプルとカンチレバーの接触点を、計算によって手動で推定するか、フィッティング曲線パラメータのセットを使用して自動的に推定します。このプロトコルに従うには、接点 の自動 推定を使用します。
- カンチレバーとサンプルの 接触点 を 、クラシックフォーカスグリッド法で決定します。
- データ分析の最適化中に経験的に決定する必要がある測定された力曲線の品質に基づいて接触点の最良の決定をもたらす 推定方法 を選択します。このプロトコルに従うには、 モデルに依存しない方法を使用します。
- クラシックモデルを使用して力のくぼみ曲線をフィットします(このプロトコルに従うには、モデルのフィットにクラシックL2を使用します)。
注: モデル 適合と接触 推定器 は、それぞれソフトウェアによる曲線の適合方法と適合曲線での接触点の確立方法を制御するパラメータです。これらの測定には、最小二乗回帰を使用する クラシック オプションが使用されました。これにより、曲線上の各低力点が試行接触点として処理され、試行接触点の前の領域に多項式が適合します。次に、適切な接触モデルを、収集された力のくぼみデータに適合させます。最小平方和を与える点が接触点と見なされます。得られた力曲線の質に基づいて他の方法を使用することができる62、63。 - モデルの フィット を 撤回 曲線に設定します。
- ポアソン比を0.45に設定します(肝臓24などの軟部組織に推奨)。
- ベースライン角度 3 と接触角度 1 を使用して曲線のフィットを設定します。モデルからの曲線の偏差のスケールに基づいて多項式適合度を変更します。
- 引き出し曲線のフィットに使用するモデルを選択します。式 (1) と式 (2) に基づいてヤング率を計算するスネドン モデルを使用します。
(1)
δ =
(2)
ここで、Fは力、Eはヤング率、vはサンプルのポアソン比、δはくぼみの深さ、aは接触半径、Rは球半径62,63です。 - 球形の先端の 半径 をマイクロメートル単位で記入します(このプロトコルでは2.9μm )。
- 読み込みを有効にして、データ ファイルから Spring 定数と InvOLS を読み込みます (チェック ボックスをオンにします)。
- [ 完了]をクリックします。
注:解析されたデータは、各力曲線について計算された垂直方向のたわみ、高さ、接着力、接触力、変形、接着力、R2 値、傾き、ヤング率、遷移押し込み、遷移力、および接触位置のマップ形式で表示されます(補足図S3、左上)。2つの追加のウィンドウには、力曲線と生の値が表示されます(補足図S3、それぞれ右上と下のパネル)。
- カンチレバーが肝臓セクションの表面に誤って接近した力曲線を除外します。これらを特定するには、 図3 で示され、他の場所で詳細に説明されているように、高ノイズ、異常な形状、および/または不完全なアプローチを持つ曲線を探します46。
(1)
(2)
図3:代表的な力-変位曲線の例。 (A,B) より硬い(A;E = 10.5 kPa)で柔らかく(B;E = 1.78 kPa)解析に適した領域。(C-F)(C-E)誤ったアプローチまたは(F)より高いノイズのために分析から除外する必要がある代表的な解釈不可能なグラフ。(A)の凡例に示されているように、赤い曲線はカンチレバーの接近を示し、緑の曲線はカンチレバーの後退を示します。黒い線は、カンチレバーの引き出し曲線のフィッティングを示しています。黒い線の傾きはヤング率に対応しています。赤と青の点は、それぞれ接触点と遷移点に対応しています。接触点は、収縮中のカンチレバーと基板の間の最後の接触点であり、遷移点は、カンチレバーのアプローチから収縮への遷移を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Representative Results
軽度に固定された、対照マウスおよび軽度または進行した線維症(それぞれ3週間または6週間のCCl4の注射によって誘発された)を有するマウスから得られた厚さ30μmの肝臓切片を、このプロトコルに記載されているようにAFMでプローブした。中心静脈に近いコラーゲン線維を剛性マップの測定のために選択した。CCl4処置動物におけるコラーゲン線維が通常形成される領域に対応する中心静脈に近い領域を、対照肝臓において分析した(図4A)。ヤング率の分布は、単一の肝臓切片内の異なる対照肝臓およびコラーゲンが豊富な領域にわたって再現可能でした(図4B:左のバイオリンプロット)。
CCl 4処理動物では、コラーゲン沈着物の周囲領域に対応する剛性マップは、対照マウスの同等の領域と比較して有意に高いヤング率の値を示しました(図4B:対照のヤング率値1.9 kPa vs. 2.6 kPaの中央値 vs 3週間CCl 4処理マウス;p = 0.07;1.9 kPa vs. 5.1 kPaの中央値 対照のヤング率値 vs. 6週間 CCl4-処置されたマウス;p = 0.02)。さらに、より長いCCl 4処理でヤング率の値に有意な増加が見られた(図4B;3週間のヤング率中央値対6週間のCCl4処置マウスのヤング率中央値2.6 kPa vs 5.1 kPa;p = 0.04)。これは、線維症の進行に伴うコラーゲン沈着物の漸進的な硬化を示しており、AFM測定値が線維形成を反映していることを示しています。
OCT包埋肝臓切片の長期保存がコラーゲン線維の機械的特性に及ぼす影響を評価するために、切断後のスライド上で-80°Cで2週間または3ヶ月間保存されたCCl4治療マウスの切片のコラーゲン線維の硬さを測定しました(図5)。AFM測定では、サンプル切片採取から2週間以内に測定した切片と比較して、3ヶ月間保存した切片のコラーゲンリッチ領域におけるヤング率の値が有意に低かった(図5;2週間保存時のヤング率の中央値4.7 kPa vs. 3.6 kPa;p < 0.001)。したがって、OCTに埋め込まれた肝葉から切片を調製した直後に肝臓組織の機械的特性を測定することが重要です。
図4:AFM測定は、長期のCCl4治療と相関するコラーゲンが豊富な領域の進行性の硬化を明らかにします。 (A)対照マウスおよびCCl4で3週間または6週間処置したマウスの肝臓切片を用いて、コラーゲンリッチ領域の機械的特性を測定した。偏光顕微鏡画像(左)に示されている肝臓切片の四角形領域は、AFM測定用に選択されたコラーゲンリッチスキャン領域(または対照肝臓の対応する領域)です(30 μm x 100 μm、10ピクセルx 36ピクセル)。これらの四角で囲まれた領域に対応するカラースケールを持つヤング率マップは、これらのマップからのヤング率値のヒストグラムを含めて右側に示されています。差し込み散布図には、各条件の値 >10 kPa が表示されます。肝臓の硬化は、ヒストグラム分布の緩やかな右へのシフトと、はめ込み散布図のポイントの頻度が高いとして視覚化されます。スケールバー = 20 μm。 (B)バイオリンプロットは、各条件で測定された3つの領域の弾性率の分布(左)と、3つのマップすべての弾性率値を要約した(右)を示しています。バイオリンプロットは、中央値(赤い線)、25パーセンタイル、75パーセンタイル(黒い線)を示しています。ドットは、エリア1〜3の個々のマップの平均値を表します。提示されたp値は、平均で実行されたスチューデントのt検定を使用して計算されました。略語:AFM =原子間力顕微鏡;CCl4 =四塩化炭素。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:肝臓切片を長期間保管すると、コラーゲンが豊富な領域の剛性が低下します。 -80°Cで2週間または3ヶ月間保存された肝臓切片(CCl4 で2週間処理したマウスから調製)を使用して、ヤング率を測定しました。AFM測定に使用したコラーゲンリッチ領域を示すボックス付きの偏光顕微鏡画像(左)(30 μm x 100 μm、10ピクセルx 36ピクセル)。カラースケールによる対応するヤング率マップ(右)。ヒストグラムは、各サンプルの4〜6個の領域から収集されたヤング率値を示します。差し込み散布図は、各条件の値>10 kPaを示しています。スケールバー= 20μm。略語:AFM =原子間力顕微鏡;CCl4 =四塩化炭素。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:メラミン樹脂マイクロビーズによるカンチレバーの改質方法。 (A)描かれた概略図は、カンチレバーの先端への球状ビーズの取り付けを示しています。段階的な説明については、セクション2、パート1、AFMカンチレバーチップへの5.7μmビーズの取り付けを参照してください。(B)カンチレバー先端に取り付けられた球状5.7μmビーズの顕微鏡像を上(左)と側面図(右)から示した。スケールバー= 20μm。略語:AFM =原子間力顕微鏡;RT =室温。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:アトミックJでのデータ解析 (A) AtomicJで剛性マップを開くために従う一連の手順。プロセスフォースカーブとマップ(x)を1回左クリックすると、処理アシスタントが開きます。ファイルを処理アシスタントにロードするには、追加(y)をクリックして必要なファイルを選択します。次へ(z)をクリックして、次の手順に進みます。(B)カーブフィッティングのパラメータ、適切な接触力学モデル、および測定中に使用されるAFM設定。ステップ1〜11は、プロトコルステップ3、セクション5、データ分析で詳述されている対応するサブポイントを参照します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:AtomicJにおける解析データの概要。 解析データのプレビューには、剛性マップ(左上のウィンドウ)、力曲線(右上のウィンドウ)、および生データ(下のウィンドウ)が表示されます。略称:AFM = 原子間力顕微鏡。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
提示されたプロトコルは、正常および線維性マウス肝臓組織のAFM測定のための段階的な再現可能な方法を提供する。結合偏光顕微鏡は、高い空間精度を提供し、複屈折によるコラーゲン線維の視覚化を可能にします。さらに、得られた力曲線の解析の詳細な説明が提供される。AFM剛性測定は細胞レベルで行うことができるため、線維性疾患の発症による肝臓組織の機械的特性の局所的な変化を監視できます。肝線維症は、臓器全体に影響を与える均質なプロセスではありません。それどころか、コラーゲンが豊富な線維性中隔の領域には、コラーゲン沈着が少ないかまったくない領域が点在しています。したがって、剛性の変化は局所的な微小環境に固有であり、損傷によって損傷を受けた領域に局所的に接触している細胞にのみ影響します。このマイクロスケールの剛性の不均一性は、AFM Youngの弾性率マップの詳細でも明らかであり、剛性の高い点はほぼ通常の剛性の領域に隣接しています。この変動は、コラーゲン瘢痕組織領域でさえ機械的に均一ではなく、細胞レベルでの特性評価にはAFM測定が必要であることを示しています(図4)。
提示されたプロトコルは、OCTに埋め込まれた肝葉全体を-80°Cで長期間保存できるため、肝臓収集とは無関係にAFMによる肝臓の硬さの測定を可能にします。 ただし、組織切片を切片したら、長期間保存した組織切片が徐々に軟化するのが観察されているため、~2週間以内にサンプルを測定することをお勧めします(図5)。
偏光顕微鏡を搭載したAFMは、肝小葉構造内の関心領域を正確に特定することができます。ただし、結果を解釈するときに考慮する必要があるいくつかの制限もあります。ここで得られた剛性値は、室温で測定した。軟組織の機械的特性に対する温度の影響は小さいと仮定します。しかし、これは、報告されている肝臓組織の機械的特性の in vivo 値とこの研究の値との間に違いがある理由の1つである可能性があります。
さらに、このプロトコルは、組織の軽度の固定を必要とする最大3時間の肝臓組織のAFM分析を可能にします。組織切片の軽度の固定、および凍結融解サイクルは、ヤング率の絶対値に影響を与える可能性が最も高いです。したがって、ヤング率の報告値は、 in vivo 値とは異なる可能性があります。肝臓切片からのヤング率の絶対値の測定のためのプロトコルを最適化するためにさらなる研究が必要であり、これは肝臓組織の固定のための異なる方法によって達成され得る64。
それにもかかわらず、CCl4 で3週間治療されたマウスの肝臓のコラーゲンが豊富な領域の硬さが6週間と比較して増加していることが観察されました。このような変化は、長期の損傷中の線維症の進行に対応し(図4)、提示されたプロトコルを使用して異なる治療間で相対的な違いを調査できることを示しています。これは、穏やかに固定された肝臓切片が、コラーゲンが豊富な領域とコラーゲンが不足している領域の間で、新鮮な組織と同様の剛性値の違いを示すことを示したCalòらの観察と一致しています25。
測定中の肝臓組織の機械的破壊を最小限に抑えるために、直径5.7μmの球状先端で変更されたSD-qp-BioT-TL-10カンチレバー(理論ばね定数~0.09 N/m)を使用しました。5.7 μmのビーズにより、サンプルの完全性を維持しながら剛性を調べるのに十分なくぼみが可能になりました。いくつかの最適化の後、剛性マップでより高い分解能を得るために、より小さな直径のビードを使用できますが、ヤング率値のさらなる過大評価につながる可能性があります(詳細については、Crichtonら65を参照)。指定されたカンチレバービーズアンサンブルを使用して、数十単位Paから~100kPaまでの広い範囲でサンプル剛性を特徴付けることができました。
スネドンのモデルは、コロイドプローブ62で深いくぼみの分析を可能にするため、力曲線からヤング率を導き出すために使用されました。スネドンのモデルは、ヘルツのモデルとは異なり、接触半径が球の半径よりもはるかに小さくなければならないという制約を受けません。さらに、試料厚さが押し込み深さ30、66の数倍であると仮定する。本研究では、コラーゲンが豊富な領域でのくぼみは~2 μmで、ビーズサイズは5.7 μm、サンプルの厚さは30 μmでした。したがって、スネドンのモデルは適切でした。先端と基板との間の接着力を考慮した他のモデル63 は、異なるタイプの組織に使用することができる。
AtomicJでの解析では、ヤング率62,67を導き出しながら基板の寄与を最小限に抑えるために、サンプルの有限の厚さの補正を実装します。得られた力曲線の解析では、軟部組織器官24に対して以前に推奨されていた0.45の単一のポアソン比を使用しました。ポアソン比の値を0.4から0.5に変更しても、スネドンの式に従って計算されたヤング率の値は0.893倍減少するだけなので、この近似はヤング率の計算値に大きな影響を与えません。CCl4治療の異なる期間間のヤング率の何倍もの差を考えると、ポアソン比を近似することによって生じる誤差はわずかです。
剛性値の計算には、くぼみ68に対する塑性応答ではなく、カンチレバーによって提供される荷重に対する組織の弾性応答に関心があったため、引き出し曲線を使用しました。軟組織の粘弾性応答により、フィッティング撤退曲線はヤング率を過大評価する可能性があり、これは留意する必要があります。さらに、アプローチ曲線を使用したデータ分析では、絶対値はそれに応じて低くなりますが、線維化領域と対照領域の間で剛性値の傾向が類似していることが観察されました(データは示されていません)。
プロトコルを最適化する際に、測定の再現性に不可欠ないくつかのステップを特定しました。まず、ビードがカンチレバーに取り付ける際に半透明の先端のほぼ中央にあることを確認することが重要です。これにより、くぼみ中の機械的不均衡を防ぐことができます。第二に、PFAによる肝臓固定中は、解凍と固定の制限時間を厳守する必要があります。このステップのタイミングを変更すると、組織切片の機械的特性に深刻な影響を与える可能性があります。第三に、カンチレバーは、温度変動による剛性値にアーティファクトが発生するのを避けるために、継続的な監視と同時温度値の入力で繰り返し校正する必要があります。最後に、重ね合わせたPBSは長期間にわたって蒸発する可能性があるため、単一の肝臓切片は準備から3時間以上測定しないでください。読者は、AFM測定中に発生した問題を解決するためにトラブルシューティング表(表3)を参照することができ、Norman et al.46でも詳しく説明されています。
表3:トラブルシューティングガイド。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
提示されたプロトコルは、肝臓組織の再現性のあるAFMプロービングを可能にする。線維性肝疾患の発症と退縮に関する情報を顕微鏡レベルで明らかにする可能性を秘めており、慢性肝疾患の進行時に形成される線維性瘢痕領域を標的とした治療法の開発に貢献する可能性があります。
Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、チェコ共和国の無償資金協力機関(18-02699S)、チェコ科学アカデミーの制度的研究プロジェクト(RVO 68378050)、およびMEYS CRプロジェクトNICR EXCELES(LX22NPO05102)の支援を受けました。CIISB、インストラクト-CZインストラクト-ERIC EUコンソーシアムセンター、MEYS CRインフラストラクチャプロジェクトLM2018127および欧州地域開発基金-プロジェクト「UP CIISB」によって資金提供されました(No.CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974)は、CFナノバイオテクノロジー、CEITEC MUでの測定を財政的に支援しました。また、MEYS(LM2018129、CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045)およびRVO:68378050-KAV-NPUIが支援する、チェコ共和国プラハの光学顕微鏡コアファシリティであるIMG CASが、ここに提示する顕微鏡イメージングのサポートについても認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM head | Bruker | JPK nanowizard 3 | |
| Cameras | Andor | Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled) | |
| The Imagingsource | S/N:12310015 | ||
| Cantilever | SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors | S/N:73750F05 | |
| Cryotome | Leica | CM1950 | |
| Epoxy resin glue (Long working time ) | Bison epoxy universal | ||
| Melamine beads; diameter, 5.7 um | Microparticles, GmbH | MF-R-5.7 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Hydrophobic slide marker | SuperHT | PAP PEN | |
| Software | JPK nanowizard v6.1.151 | ||
| AtomicJ v2.3.1 | |||
| Superfrost slides | Thermoscientific | ref no. J1800AMNZ | |
| System | Ubuntu 14.04.5 LTS | ||
| Vibration isolation control unit | Tablestable | AVI-200-S |
References
- vanden Berghe, G. The role of the liver in metabolic homeostasis: Implications for inborn errors of metabolism. Journal of Inherited Metabolic Dis. 14 (4), 407-420 (1991).
- Stanger, B. Z. Cellular homeostasis and repair in the mammalian liver. Annual Reviews of Physiology. 77, 179-200 (2015).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L.
- Georges, P. C., et al. Increased stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: Implications for fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (6), 1147-1154 (2007).
- Perepelyuk, M., et al. Hepatic stellate cells and portal fibroblasts are the major cellular sources of collagens and lysyl oxidases in normal liver and early after injury. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (6), 605-614 (2013).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (5), 1394-1400 (2008).
- Olsen, A. L., et al. Hepatic stellate cells require a stiff environment for myofibroblastic differentiation. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (1), 110-118 (2011).
- Sandrin, L., et al. Transient elastography: A new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis. Ultrasound in Medicine & Biology. 29 (12), 1705-1713 (2003).
- Ling, W., et al. Effects of vascularity and differentiation of hepatocellular carcinoma on tumor and liver stiffness: In vivo and in vitro studies. Ultrasound in Medicine & Biology. 40 (4), 739-746 (2014).
- Wong, V. W. S., et al. Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 51 (2), 454-462 (2010).
- Cha, S. W., et al. Nondiseased liver stiffness measured by shearwave elastography a pilot study. Journal of Ultrasound in Medicine. 33 (1), 53-60 (2014).
- Castera, L., Forns, X., Alberti, A. Non-invasive evaluation of liver fibrosis using transient elastography. Journal of Hepatology. 48 (5), 835-847 (2008).
- Chang, W., et al. Liver fibrosis staging with MR elastography: Comparison of diagnostic performance between patients with chronic hepatitis B and those with other etiologic causes. Radiology. 280 (1), 88-97 (2016).
- Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Clinical applications. Journal of Computer Assisted Tomography. 37 (6), 887-896 (2013).
- Venkatesh, S. K., Yin, M., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography of liver: Technique, analysis and clinical applications. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (3), 544-555 (2013).
- Venkatesh, S. K., Wang, G., Teo, L. L. S., Ang, B. W. L. Magnetic resonance elastography of liver in healthy Asians: Normal liver stiffness quantification and reproducibility assessment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 1-8 (2014).
- Lee, D. H., Lee, J. M., Han, J. K., Choi, B. I. MR elastography of healthy liver parenchyma: Normal value and reliability of the liver stiffness value measurement. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 38 (5), 1215-1223 (2013).
- Mueller, S. Liver stiffness: A novel parameter for the diagnosis of liver disease. Hepatic Medicine. Evidence and Research. 2, 49-67 (2010).
- Goodman, Z. D. Grading and staging systems for inflammation and fibrosis in chronic liver diseases. Journal of Hepatology. 47 (4), 598-607 (2007).
- Salameh, N., et al. Hepatic viscoelastic parameters measured with MR elastography: Correlations with quantitative analysis of liver fibrosis in the rat. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 26 (4), 956-962 (2007).
- Yin, M., et al. Quantitative assessment of hepatic fibrosis in an animal model with magnetic resonance elastography. Magnetic Resonance in Medicine. 58 (2), 346-353 (2007).
- Bastard, C., et al. Transient micro-elastography: A novel non-invasive approach to measure liver stiffness in mice. World Journal of Gastroenterology. 17 (8), 968-975 (2011).
- Barnes, S. L., Lyshchik, A., Washington, M. K., Gore, J. C., Miga, M. I. Development of a mechanical testing assay for fibrotic murine liver. Medical Physics. 34 (11), 4439-4450 (2007).
- Calò, A., et al. Spatial mapping of the collagen distribution in human and mouse tissues by force volume atomic force microscopy. Scientific Reports. 10, 15664 (2020).
- Desai, S. S., et al. Physiological ranges of matrix rigidity modulate primary mouse hepatocyte function in part through hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Hepatology. 64 (1), 261-275 (2016).
- Kostallari, E., et al. Stiffness is associated with hepatic stellate cell heterogeneity during liver fibrosis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 322 (2), 234-246 (2022).
- Binnig, G., Qaute, C. F., Gerber, C.
- Johnson, K. L. Contact Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1985).
- Asgari, M., Latifi, N., Giovanniello, F., Espinosa, H. D., Amabili, M. Revealing layer-specific ultrastructure and nanomechanics of fibrillar collagen in human aorta via atomic force microscopy testing: Implications on tissue mechanics at macroscopic scale. Advanced NanoBiomed Research. 2 (5), 2100159 (2022).
- Amabili, M., et al. Microstructural and mechanical characterization of the layers of human descending thoracic aortas. Acta Biomaterialia. 134, 401-421 (2021).
- Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: Effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomaterialia. 8 (11), 4123-4129 (2012).
- Geerligs, M., et al. In vitro indentation to determine the mechanical properties of epidermis. Journal of Biomechanics. 44 (6), 1176-1181 (2011).
- Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (54), e2911 (2011).
- Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
- Babu, P. K. V., Radmacher, M. Mechanics of brain tissues studied by atomic force microscopy: A perspective. Frontiers in Neuroscience. 13, 600 (2019).
- del Mar Vivanco, M. Mammary Stem Cells: Methods and protocols. , Springer. New York. (2015).
- Zanetti-Dällenbach, R., et al. Length scale matters: Real-time elastography versus nanomechanical profiling by atomic force microscopy for the diagnosis of breast lesions. Biomed Research International. 2018, 3840597 (2018).
- Lopez, J. I., Kang, I., You, W. -K., McDonald, D. M., Weaver, V. M. In situ force mapping of mammary gland transformation. Integrative Biology. 3 (9), 910-921 (2011).
- Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnol. 4 (3), 186-192 (2009).
- Borin, D., Pecorari, I., Pena, B., Sbaizero, O. Novel insights into cardiomyocytes provided by atomic force microscopy. Seminars in Cell & Developmental Biology. 73, 4-12 (2018).
- Lachaize, V., et al. Atomic Force Microscopy: An innovative technology to explore cardiomyocyte cell surface in cardiac physio/pathophysiology. Letters in Applied NanoBioScience. 4 (4), 321-324 (2015).
- Lieber, S. C., et al. Aging increases stiffness of cardiac myocytes measured by atomic force microscopy nanoindentation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (2), 645-651 (2004).
- Guedes, A. F., et al. Atomic force microscopy as a tool to evaluate the risk of cardiovascular diseases in patients. Nature Nanotechnology. 11 (8), 687-692 (2016).
- Zhu, Y., Dong, Z., Wejinya, U. C., Jin, S., Ye, K. Determination of mechanical properties of soft tissue scaffolds by atomic force microscopy nanoindentation. Journal of Biomechanics. 44 (13), 2356-2361 (2011).
- Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of Young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
- Scholten, D., Trebicka, J., Liedtke, C., Weiskirchen, R. The carbon tetrachloride model in mice. Laboratory Animals. 49, 4-11 (2015).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ribeiro, J. F., dos Anjos, E. H. M., Mello, M. L. S., de Campos Vidal, B. Skin collagen fiber molecular order: A pattern of distributional fiber orientation as assessed by optical anisotropy and image analysis. PLoS One. 8 (1), 54724 (2013).
- Ozkan, A., et al. The influence of chronic liver diseases on hepatic vasculature: A liver-on-a-chip review. Micromachines. 11 (5), 487 (2020).
- Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).
- Khajehahmadi, Z., et al. Liver stiffness correlates with serum osteopontin and TAZ expression in human liver cirrhosis. Annals of the New York Academy of Sciences. 1465 (1), 117-131 (2020).
- Tian, M., et al. The nanomechanical signature of liver cancer tissues and its molecular origin. Nanoscale. 7 (30), 12998-13010 (2015).
- Zhao, G., et al. Mechanical stiffness of liver tissues in relation to integrin β1 expression may influence the development of hepatic cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 102 (5), 482-489 (2010).
- Gang, Z., Qi, Q., Jing, C., Wang, C. Measuring microenvironment mechanical stress of rat liver during diethylnitrosamine induced hepatocarcinogenesis by atomic force microscope. Microscopy Research and Technique. 72 (9), 672-678 (2009).
- Sader, J. E., et al. Spring constant calibration of atomic force microscope cantilevers of arbitrary shape. The Review of Scientific Instruments. 83 (10), 103705 (2012).
- JPK Instruments. A practical guide to AFM force spectroscopy and data analysis. JPK Instruments Technical Note. JPK Instruments. , 1-8 (2016).
- van Eysden, C. A., Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids. Journal of Applied Physics. 101, 044908 (2015).
- Kim, Y., Yang, Y. I., Choi, I., Yi, J. Dependence of approaching velocity on the force-distance curve in AFM analysis. Korean Journal of Chemical Engineering. 27, 324-327 (2010).
- Hermanowicz, P., Sarna, M., Burda, K., Gabryś, H. AtomicJ: An open source software for analysis of force curves. The Review of Scientific Instruments. 85 (6), 063703 (2014).
- Hermanowicz, P. AtomicJ 2.3.1 User's Manual. , (2021).
- Iwashita, M., et al. Comparative Analysis of Brain Stiffness Among Amniotes Using Glyoxal Fixation and Atomic Force Microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
- Crichton, M. L., et al. The viscoelastic, hyperelastic and scale dependent behaviour of freshly excised individual skin layers. Biomaterials. 32 (20), 4670-4681 (2011).
- Puricelli, L., Galluzzi, M., Schulte, C., Podestà, A., Milani, P. Nanomechanical and topographical imaging of living cells by atomic force microscopy with colloidal probes. The Review of Scientific Instruments. 86 (3), 033705 (2015).
- Hermanowicz, P. Determination of Young's modulus of samples of arbitrary thickness from force distance curves: Numerical investigations and simple approximate formulae. International Journal of Mechanical Sciences. 193, 106138 (2021).
- Han, R., Chen, J. A modified Sneddon model for the contact between conical indenters and spherical samples. Journal of Materials Research. 36, 1762-1771 (2021).
