유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집
Summary
본 프로토콜은 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 위한 최적화된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 배양 절차를 설명합니다.
Abstract
CRISPR/Cas9는 다양한 유전적 돌연변이를 교정하기 위해 널리 채택된 매우 다재다능하고 효율적인 유전자 편집 도구입니다. 시험관 내에서 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 유전자 조작의 타당성은 HSPC를 유전자 치료를위한 이상적인 표적 세포로 만듭니다. 그러나 HSPC는 생체 외 배양에서 생착 및 다중 계통 재 집단 잠재력을 적당히 잃습니다. 본 연구에서, HSPC 생착을 개선하고 생체내에서 증가된 수의 유전자-변형 세포를 생성하는 이상적인 배양 조건이 기술된다. 현재 보고서는 배양 배지 유형, 고유한 저분자 칵테일 보충제, 사이토카인 농도, 세포 배양 플레이트 및 배양 밀도를 포함하여 최적화된 체외 배양 조건을 표시합니다. 그 외에도 유전자 편집 이벤트의 검증과 함께 최적화된 HSPC 유전자 편집 절차가 제공됩니다. 생체내 검증을 위해, 마우스 수용자에서의 유전자 편집된 HSPC 주입 및 생착 후 분석이 표시된다. 결과는 배양 시스템이 시험관 내에서 기능성 HSC의 빈도를 증가시켜 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 초래한다는 것을 입증했습니다.
Introduction
동종 이식 환경에서 인간 백혈구 항원(HLA)과 일치하는 기증자에 접근할 수 없고 매우 다재다능하고 안전한 유전 공학 도구의 급속한 개발로 인해 자가 조혈모세포 이식(HSCT)은 유전성혈액 질환에 대한 치료 전략이 되었습니다1,2. 자가 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 유전자 치료는 환자의 HSPC 수집, 유전자 조작, 질병 유발 돌연변이의 교정 및 유전자 교정 된 HSPC를 환자에게 이식하는 것을 포함합니다 3,4. 그러나 유전자 치료의 성공적인 결과는 이식 가능한 유전자 변형 이식편의 품질에 달려 있습니다. HSPC의 유전자 조작 단계 및 생체 외 배양은 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)의 빈도를 감소시켜 이식편의 품질에 영향을 미치므로 유전자 조작 HSPC 2,5,6을 다량 주입해야합니다.
SR1 및 UM171을 포함한 여러 소분자가 현재 제대혈 HSPC를 강력하게 확장하기 위해 사용되고 있습니다 7,8. 성인 HSPC의 경우, 동원시 얻은 더 높은 세포 수율로 인해 강력한 확장이 필요하지 않습니다. 그러나 생체 외 배양에서 분리된 HSPC의 줄기를 유지하는 것은 유전자 치료 응용 분야에 매우 중요합니다. 따라서 조혈모세포(HSC)의 배양 농축에 초점을 맞춘 접근법은 레스베라트롤, UM729 및 SR1(RUS)7과 같은 소분자의 조합을 사용하여 개발됩니다. 최적화된 HSPC 배양 조건은 HSC의 농축을 촉진하여 생체 내에서 유전자 변형 HSC의 빈도를 증가시키고 다량의 HSPC를 조작하는 유전자의 필요성을 줄여 비용 효율적인 유전자치료 접근법을 용이하게 합니다8.
여기에서는 생체 내에서 유전자 편집 세포의 주입 및 분석과 함께 HSPC 배양을 위한 포괄적인 프로토콜이 설명됩니다.
Protocol
면역결핍 마우스에 대한 생체내 실험은 인도 벨로르에 있는 크리스천 의과 대학의 동물 윤리 위원회(IAEC) 연구소의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF) 동원 된 말초 혈액 샘플은 기관 검토위원회 (IRB) 승인을 얻은 후 정보에 입각 한 동의하에 건강한 인간 기증자로부터 수집되었습니다. 1. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMNC)의 분리 및 CD34…
Representative Results
본 연구는 생체 외 배양에서 CD34+CD133+CD90+ HSC의 보유를 용이하게 하는 이상적인 HSPC 배양 조건을 식별합니다. 유전자 변형 HSC의 향상된 생성과 함께 HSC의 배양 농축을 입증하기 위해 PBMNC 분리, CD34+ 세포 정제, 배양, 유전자 편집, 이식, 생착 특성화 및 생체 내 유전자 변형 세포를 위한 최적화된 절차가 제공됩니다(그림 1). 정제 후…
Discussion
HSPC 유전자 치료의 성공적인 결과는 주로 이식편에서 생착 가능한 HSC의 품질과 양에 달려 있습니다. 그러나 HSC의 기능적 특성은 체외 배양 및 유전자 조작 절차와 관련된 독성을 포함하여 유전자 치료 제품의 준비 단계에서 크게 영향을받습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 생체 외 배양에서 CD34+CD133+CD90+ HSC의 줄기를 유지하는 이상적인 HSPC 배양 조?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 CSCR의 유세포 분석 시설 및 동물 시설의 직원을 인정하고자합니다. A. C.는 ICMR-SRF 펠로우십, K. V. K.는 DST-INSPIRE 펠로우십, PB는 CSIR-JRF 펠로우십에서 자금을 지원합니다. 이 작업은 인도 정부 생명공학부(보조금 번호 BT/PR26901/MED/31/377/2017 및 BT/PR31616/MED/31/408/2019)에서 자금을 지원했습니다.
Materials
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | – | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | – | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |
Riferimenti
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
- Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
- Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major – From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
- Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
- Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
- Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
- Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
- Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
- Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
- Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, 21-24 (2006).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
- Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
- Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
- Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
- Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
- Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
Citazione di questo articolo
Venkatesan, V., Christopher, A. C., Karuppusamy, K. V., Babu, P., Alagiri, M. K. K., Thangavel, S. CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications. J. Vis. Exp. (186), e64064, doi:10.3791/64064 (2022).