CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi
Summary
Mevcut protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanması için optimize edilmiş bir hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) kültür prosedürünü tanımlamaktadır.
Abstract
CRISPR / Cas9, çeşitli genetik mutasyonları düzeltmek için yaygın olarak benimsenen çok yönlü ve verimli bir gen düzenleme aracıdır. Hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC’ler) in vitro gen manipülasyonunun fizibilitesi, HSPC’leri gen tedavisi için ideal bir hedef hücre haline getirmektedir. Bununla birlikte, HSPC’ler ex vivo kültürde engraftment ve multilineage repopulasyon potansiyellerini orta derecede kaybederler. Bu çalışmada, HSPC engraftmanını geliştiren ve in vivo olarak artan sayıda gen modifiye hücre üreten ideal kültür koşulları tanımlanmıştır. Mevcut rapor, kültür ortamının türü, benzersiz küçük moleküllü kokteyl takviyesi, sitokin konsantrasyonu, hücre kültürü plakaları ve kültür yoğunluğu dahil olmak üzere optimize edilmiş in vitro kültür koşullarını göstermektedir. Buna ek olarak, optimize edilmiş bir HSPC gen düzenleme prosedürü, gen düzenleme olaylarının doğrulanması ile birlikte sağlanır. İn vivo doğrulama için, fare alıcılarında gen düzenlenmiş HSPC’lerin infüzyonu ve engraftman sonrası analizi görüntülenir. Sonuçlar, kültür sisteminin fonksiyonel HSC’lerin sıklığını in vitro olarak arttırdığını ve gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanmasını sağladığını göstermiştir.
Introduction
Allojenik transplantasyon ortamlarında insan lökosit antijeni (HLA) ile eşleşen donörlere erişilememesi ve çok yönlü ve güvenli genetik mühendisliği araçlarının hızla geliştirilmesi, otolog hematopoetik kök hücre transplantasyonunu (HKHN) kalıtsal kan hastalıkları için iyileştirici bir tedavi stratejisi haline getirmektedir 1,2. Otolog hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) gen tedavisi, hastaların HSPC’lerinin toplanmasını, genetik manipülasyonu, hastalığa neden olan mutasyonların düzeltilmesini ve gen düzeltilmiş HSPC’lerin hastaya transplantasyonunu içerir 3,4. Bununla birlikte, gen tedavisinin başarılı sonucu, nakledilebilir gen modifiye greftin kalitesine bağlıdır. HSPC’lerin gen manipülasyon adımları ve ex vivo kültürü, uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC’ler) sıklığını azaltarak greft kalitesini etkiler ve büyük dozlarda gen ile manipüle edilmiş HSPC’lerininfüzyonunu gerektirir 2,5,6.
SR1 ve UM171 de dahil olmak üzere birkaç küçük molekül şu anda kordon kanı HSPC’lerini 7,8 oranında genişletmek için kullanılmaktadır. Yetişkin HSPC’ler için, mobilizasyonda elde edilen daha yüksek hücre verimi nedeniyle, sağlam genleşme gerekli değildir. Bununla birlikte, ex vivo kültürde izole HSPC’lerin sapını korumak, gen terapisi uygulamaları için çok önemlidir. Bu nedenle, hematopoetik kök hücrelerin (HSC’ler) kültür zenginleştirilmesine odaklanan bir yaklaşım, küçük moleküllerin bir kombinasyonu kullanılarak geliştirilmiştir: Resveratrol, UM729 ve SR1 (RUS)7. Optimize edilmiş HSPC kültür koşulları, HSC’lerin zenginleşmesini teşvik eder, bu da gen modifiye HSC’lerin in vivo sıklığının artmasına neden olur ve yüksek dozlarda HSPC’leri manipüle eden gen ihtiyacını azaltır ve uygun maliyetli gen terapisi yaklaşımlarını kolaylaştırır8.
Burada, HSPC’lerin kültürü için kapsamlı bir protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo infüzyonu ve analizi ile birlikte açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
HSPC gen tedavisinin başarılı sonucu, ağırlıklı olarak greftteki engraflanabilir HSC’lerin kalitesine ve miktarına bağlıdır. Bununla birlikte, HSC’lerin fonksiyonel özellikleri, gen manipülasyon prosedürü ile ilişkili in vitro kültür ve toksisite de dahil olmak üzere, gen terapisi ürünlerinin hazırlık aşamasında oldukça etkilenir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, ex vivo kültürde CD34 + CD133 + CD90 + HSC’lerin kökünü koruyan ideal HSPC<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, CSCR’nin akış sitometri tesisinin ve hayvan tesisinin personelini kabul etmek istemektedir. A. C. ICMR-SSF bursu, K. V. K. DST-INSPIRE bursu ve P. B. CSIR-JRF bursu tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bakanlığı tarafından finanse edilmiştir (hibe no. BT/PR26901/MED/31/377/2017 ve BT/PR31616/MED/31/408/2019)
Materials
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | – | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | – | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |
Riferimenti
- Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives. Frontiers in Pediatrics. 7, 443 (2019).
- Naldini, L. Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives. EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958 (2019).
- Srivastava, A., Shaji, R. V. Cure for thalassemia major – From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy. Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).
- Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies. Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253 (2020).
- Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment. Blood. 103 (2), 545-552 (2004).
- Piras, F., et al. Lentiviral vectors escape innate sensing but trigger p53 in human hematopoietic stem and progenitor cells. EMBO Molecular Medicine. 9 (9), 1198-1211 (2017).
- Christopher, A. C., et al. Preferential expansion of human CD34+CD133+CD90+ hematopoietic stem cells enhances gene-modified cell frequency for gene therapy. Human Gene Therapy. 33 (3-4), 188-201 (2021).
- Karuppusamy, K. V., et al. The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Frontiers in Immunology. 13, 792684 (2022).
- Hopman, R. K., DiPersio, J. F. Advances in stem cell mobilization. Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).
- Hoffman, T. L. Counting Cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 1, 21-24 (2006).
- Antoniani, C., et al. Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus. Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).
- Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy. Stem Cell Research & Therapy. 12, 500 (2021).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Bagchi, A., et al. Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells. Cells. 10 (3), 1-18 (2021).
- Ravi, R., et al. Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin. eLife. 11, 65421 (2020).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Leonard, A., et al. Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).
- Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice. Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).
- Audigé, A., et al. Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells. BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. Fc-receptors as regulators of immunity. Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).
- Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
- Ngom, M., et al. UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).
- Park, Y. S., et al. Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules. Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214 (2022).
- Aiuti, A., et al. Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Rai, R., et al. Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing. bioRxiv. , (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
