Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica
Summary
El presente protocolo describe un procedimiento optimizado de cultivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para el injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.
Abstract
CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición de genes altamente versátil y eficiente adoptada ampliamente para corregir diversas mutaciones genéticas. La viabilidad de la manipulación génica de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) in vitro hace que las HSPC sean una célula diana ideal para la terapia génica. Sin embargo, las HSPC pierden moderadamente su potencial de injerto y repoblación multilinaje en el cultivo ex vivo . En el presente estudio, se describen las condiciones ideales de cultivo que mejoran el injerto de HSPC y generan un mayor número de células modificadas genéticamente in vivo. El informe actual muestra condiciones de cultivo in vitro optimizadas, incluido el tipo de medio de cultivo, la suplementación única de cóctel de moléculas pequeñas, la concentración de citoquinas, las placas de cultivo celular y la densidad de cultivo. Además de eso, se proporciona un procedimiento optimizado de edición de genes HSPC, junto con la validación de los eventos de edición de genes. Para la validación in vivo , se muestran los análisis de infusión y post-injerto de HSPC editados genéticamente en receptores de ratón. Los resultados demostraron que el sistema de cultivo aumentó la frecuencia de HSC funcionales in vitro, lo que resultó en un injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.
Introduction
La inaccesibilidad a donantes compatibles con antígenos leucocitarios humanos (HLA) en entornos de trasplante alogénico y el rápido desarrollo de herramientas de ingeniería genética altamente versátiles y seguras hacen del trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas (TCMH) una estrategia de tratamiento curativo para los trastornos sanguíneos hereditarios 1,2. La terapia génica autóloga con células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPC) implica la recolección de HSPC de los pacientes, la manipulación genética, la corrección de mutaciones causantes de enfermedades y el trasplante de HSPC corregidas genéticamente en el paciente 3,4. Sin embargo, el resultado exitoso de la terapia génica depende de la calidad del injerto trasplantable modificado genéticamente. Los pasos de manipulación génica y el cultivo ex vivo de HSPC afectan la calidad del injerto al disminuir la frecuencia de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSCs), lo que requiere la infusión de grandes dosis de HSPC manipuladas genéticamente 2,5,6.
Varias moléculas pequeñas, incluyendo SR1 y UM171, se están empleando actualmente para expandir robustamente las HSPC de la sangre del cordón umbilical 7,8. Para las HSPC adultas, debido al mayor rendimiento celular obtenido en la movilización, no se requiere una expansión robusta. Sin embargo, la retención del tallo de las HSPC aisladas en cultivo ex vivo es crucial para sus aplicaciones de terapia génica. Por lo tanto, se desarrolla un enfoque centrado en el enriquecimiento en cultivo de células madre hematopoyéticas (HSC) utilizando una combinación de moléculas pequeñas: resveratrol, UM729 y SR1 (RUS)7. Las condiciones optimizadas de cultivo de HSPC promueven el enriquecimiento de HSCs, resultando en una mayor frecuencia de HSCs modificadas genéticamente in vivo, y reducen la necesidad de manipular genes grandes dosis de HSPCs, facilitando enfoques de terapia génica rentables8.
Aquí, se describe un protocolo integral para el cultivo de HSPCs, junto con la infusión y el análisis de células editadas genéticamente in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El resultado exitoso de la terapia génica HSPC depende predominantemente de la calidad y cantidad de HSC injertables en el injerto. Sin embargo, las propiedades funcionales de las HSC se ven muy afectadas durante la fase preparatoria de los productos de terapia génica, incluso por el cultivo in vitro y la toxicidad asociada con el procedimiento de manipulación génica. Para superar estas limitaciones, hemos identificado condiciones ideales de cultivo de HSPC que conservan el tallo de las HSC CD34 + CD133 + CD…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren reconocer al personal de la instalación de citometría de flujo y la instalación de animales de CSCR. A. C. está financiado por una beca ICMR-SRF, K. V. K. está financiado por una beca DST-INSPIRE y P. B. está financiado por una beca CSIR-JRF. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India (subvención no. BT / PR26901 / MED / 31/377 / 2017 y BT / PR31616 / MED / 31/408 / 2019)
Materials
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | – | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | – | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN – INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | – |
Riferimenti
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