שיטת סינון פשוטה לבידוד בועיות חוץ-תאיות קטנות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים
Summary
פרוטוקול זה מדגים כיצד לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי (hUC-MSC-sEVs) באמצעות הגדרה פשוטה בקנה מידה של מעבדה. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, סמני sEVs והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV מבודדים מאופיינים בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה.
Abstract
התהליך מבוסס האולטרה-צנטריפוגה נחשב לשיטה הנפוצה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs). עם זאת, התשואה משיטת בידוד זו נמוכה יחסית, ושיטות אלה אינן יעילות בהפרדת תת-סוגים של sEV. מחקר זה מדגים שיטת סינון פשוטה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מסוג MSC (hUC-MSC-sEVs) שמקורן בחבל הטבור האנושי, המופרדות בהצלחה על-ידי אולטרה-סינון מהמדיום המותנה של hUC-MSCs. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, הסמנים האקזוזומליים (CD9, CD81, TSG101) והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV המבודדים אופיינו בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה. גודלם של ה-hUC-MSC-sEV המבודדים היה 30-200 ננומטר, עם ריכוז חלקיקים של 7.75 ×-10 10 חלקיקים/מ”ל וריכוז חלבון של80 מק”ג/מ”ל. נצפו פסים חיוביים לסמנים אקסוזומליים CD9, CD81 ו-TSG101. מחקר זה הראה כי hUC-MSC-sEV בודדו בהצלחה מתווך מותנה hUC-MSCs, ואפיון הראה כי המוצר המבודד עמד בקריטריונים שהוזכרו על ידי מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 (MISEV 2018).
Introduction
על פי MISEV 2018, sEVs הם חלקיקים דו-שכבתיים ליפידים שאינם משכפלים ללא גרעין פונקציונלי, בגודל של 30-200 ננומטר1. sEV שמקורם ב-MSC מכיל מולקולות איתות חשובות הממלאות תפקידים חשובים בהתחדשות רקמות, כגון מיקרו-רנ”א, ציטוקינים או חלבונים. הם הפכו יותר ויותר ל”נקודה חמה” מחקרית ברפואה רגנרטיבית ובטיפול ללא תאים. מחקרים רבים הראו כי sEV שמקורו ב-MSC יעיל כמו MSC בטיפול במצבים שונים, כגון אימונומודולציה 2,3,4,5, שיפור אוסטאוגנזה 6, סוכרת7,8 או התחדשות כלי דם 9,10. עם התקדמות ניסויי השלב המוקדם, הודגשו שלוש סוגיות מפתח עיקריות ביחס לתרגום הקליני של MSCs-EVs: תפוקת כלי הרכב החשמליים, טוהר כלי הרכב החשמליים (נקיים מפסולת תאים ומזהמים ביולוגיים אחרים כגון חלבון וציטוקינים), ושלמות הממברנה הדו-שכבתית הפוספוליפידית של כלי הרכב החשמליים לאחר בידוד.
שיטות שונות פותחו כדי לבודד sEVs, תוך ניצול הצפיפות, הצורה, הגודל וחלבון פני השטח של sEVs11. שתי השיטות הנפוצות ביותר בבידודים של כלי רכב חשמליים הן טכניקות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה ואולטרה-סינון.
שיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה נחשבות לשיטות תקן זהב בבידוד כלי רכב חשמליים. שני סוגים של טכניקות אולטרה-צנטריפוגות המשמשות בדרך כלל הן אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית ואולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. עם זאת, שיטות אולטרה-צנטריפוגות גורמות לעתים קרובות לתפוקה נמוכה ודורשות ציוד יקר עבור אולטרה-צנטריפוגות במהירות גבוהה (100,000-200,000 × גרם)11. יתר על כן, טכניקות אולטרה-צנטריפוגה לבדן אינן יעילות בהפרדת תת-סוגים של כלי רכב חשמליים (sEV ורכבים חשמליים גדולים), וכתוצאה מכך נוצרת שכבת משקעים לא טהורה11. לבסוף, אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות עשויה גם היא לגזול זמן רב ולדרוש צעדי זהירות נוספים כגון תוספת חיץ סוכרוז כדי לעכב את נזקי השיפוע במהלך שלבי האצה והאטה12. לפיכך, אולטרה-צנטריפוגה מובילה בדרך כלל לתנובה נמוכה יחסית ואינה מסוגלת להפלות בין אוכלוסיות שונות של כלי רכב חשמליים13, מה שמגביל את יישומה להכנת רכב חשמלי בקנה מידה גדול11.
השיטה השנייה לבידוד רכב חשמלי היא באמצעות אולטרה-פילטרציה, המבוססת על סינון גודל. אולטרה-סינון הוא חסכוני יחסית בזמן ובהשוואה לאולטרה-צנטריפוגה, מכיוון שהוא אינו כרוך בציוד יקר או בזמני עיבוד ארוכים14. לפיכך, אולטרה-סינון נראה כטכניקת בידוד יעילה יותר משתי שיטות האולטרה-צנטריפוגה שהוזכרו לעיל. המוצרים המבודדים יכולים להיות ספציפיים יותר בהתבסס על גודל הנקבוביות ותפוקה גבוהה יותר15. עם זאת, הכוח הנוסף המופעל בתהליך הסינון עלול לגרום לעיוות או התפרצות של כלי הרכב החשמליים16.
המאמר הנוכחי הציע פרוטוקול benchtop חסכוני וזמן לבידוד sEV הנגזרים מ- MSC לצורך ניתוח במורד הזרם ולמטרות טיפוליות. השיטה המתוארת במאמר זה שילבה שיטת סינון פשוטה עם צנטריפוגה עליונה כדי לבודד כלי רכב חשמליים בעלי תפוקה גבוהה ובאיכות טובה מ- hUC-MSCs לצורך ניתוח במורד הזרם, כולל ניתוח גודל חלקיקים, בדיקת סמנים ביולוגיים והדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כלי רכב חשמליים הם אחת מתת-הקבוצות החשובות של ההפרשה ב-MSCs הממלאים תפקיד מכריע במהלך תהליכים נורמליים ופתולוגיים. עם זאת, sEVs, עם טווח גודל בין 30 ל -200 ננומטר, עלו ככלי פוטנציאלי לטיפול ללא תאים בעשור האחרון. טכניקות שונות פותחו כדי לבודד sEV מ MSCs. עם זאת, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, אולטרה-סינ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרסום סרטון זה נתמך על ידי My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
Riferimenti
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. . Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Wei, Y., et al. . Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
