ヒト間葉系幹細胞から小さな細胞外小胞を単離するための簡単なベンチトップろ過法
Summary
このプロトコルは、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の小さな細胞外小胞(hUC-MSC-sEV)を、シンプルなラボスケールのベンチトップ設定で分離する方法を示しています。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズ分布、タンパク質濃度、sEVマーカー、および形態は、それぞれナノ粒子追跡分析、BCAタンパク質アッセイ、ウェスタンブロット、および透過型電子顕微鏡によって特徴付けられます。
Abstract
超遠心分離ベースのプロセスは、小さな細胞外小胞(sEV)単離の一般的な方法と考えられています。ただし、この分離方法からの収率は比較的低く、これらの方法はsEVサブタイプの分離に非効率的です。この研究は、ヒト臍帯由来MSC小細胞外小胞(hUC-MSC-sEV)を分離するための簡単なベンチトップろ過方法を示し、hUC-MSCの馴化培地から限外ろ過によって分離することに成功しました。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズ分布、タンパク質濃度、エキソソームマーカー(CD9、CD81、TSG101)、および形態を、ナノ粒子追跡分析、BCAタンパク質アッセイ、ウェスタンブロット、および透過型電子顕微鏡でそれぞれ特徴付けました。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズは30-200 nmで、粒子濃度は7.75 ×10 10 粒子/mL、タンパク質濃度は80 μg/mLでした。エキソソームマーカーCD9、CD81、およびTSG101の陽性バンドが観察された。この研究は、hUC-MSC-sEVがhUC-MSCs馴化培地から首尾よく単離されることを示し、特性評価は、単離された製品が細胞外小胞の研究のための最小情報2018(MISEV 2018)で言及された基準を満たすことを示しました。
Introduction
MISEV 2018によると、sEVは、機能性核が存在しない非複製脂質二重層粒子であり、サイズは30〜200 nm1です。MSC由来のsEVには、マイクロRNA、サイトカイン、タンパク質など、組織再生に重要な役割を果たす重要なシグナル伝達分子が含まれています。それらはますます再生医療と無細胞治療の研究「ホットスポット」になっています。多くの研究により、MSC由来のsEVは、免疫調節2,3,4,5、骨形成の増強6、糖尿病7,8、血管再生9,10などのさまざまな状態の治療においてMSCと同じくらい効果的であることが示されています。初期段階の試験が進むにつれて、MSC-EVの臨床翻訳に関連する3つの主要な重要な問題が強調されています:EVの収量、EVの純度(細胞破片やタンパク質やサイトカインなどの他の生物学的汚染物質を含まない)、および分離後のEVのリン脂質二重膜の完全性。
sEV11の密度、形状、サイズ、および表面タンパク質を利用して、sEVを分離するためのさまざまな方法が開発されています。sEVの分離で最も一般的な2つの方法は、超遠心分離ベースと限外ろ過ベースの技術です。
超遠心分離ベースの方法は、EV分離におけるゴールドスタンダードの方法と見なされています。通常採用される2種類の超遠心分離技術は、示差超遠心分離および密度勾配超遠心分離である。しかし、超遠心分離法は収率が低く、高速超遠心分離機(100,000〜200,000 × g)には高価な装置を必要とすることがよくあります11。さらに、超遠心分離技術だけでは、EVサブタイプ(sEVおよび大型EV)を分離するのに非効率的であり、不純な堆積物層11をもたらす。最後に、密度勾配超遠心分離も時間がかかり、加速および減速ステップ12中のグラジエント損傷を抑制するためにスクロースバッファー添加などの追加の予防ステップを必要とする可能性があります。したがって、超遠心分離は通常、比較的低い収率をもたらし、EVの異なる集団を区別することができず13、大規模なEV調製への適用を制限する11。
EV単離の2番目の方法は、サイズろ過に基づく限外ろ過によるものです。限外ろ過は、高価な装置や長い処理時間を必要としないため、超遠心分離と比較して比較的時間と費用効果が高いです14。したがって、限外ろ過は、前述の両方の超遠心分離方法よりも効果的な単離技術であるように思われます。単離された生成物は、細孔サイズおよびより高い収率に基づいてより具体的にすることができる15。しかしながら、濾過プロセス中に発生する追加の力は、EV16の変形または噴火をもたらす可能性がある。
本論文では、MSC由来のsEVをダウンストリーム分析および治療目的で単離するための費用対効果と時間効率の高いベンチトッププロトコルを提案しました。この論文に記載されている方法は、単純なろ過方法とベンチトップ遠心分離を組み合わせて、粒子サイズ分析、バイオマーカーアッセイ、電子顕微鏡イメージングなどのダウンストリーム分析のために、hUC-MSCから高収率で高品質のEVを分離しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
EVは、MSCのセクレトームの重要なサブセットの1つであり、正常および病理学的プロセス中に重要な役割を果たします。しかし、サイズ範囲が30〜200nmのsEVは、過去10年間で無細胞治療の潜在的なツールとして台頭しています。MSCからsEVを分離するために、さまざまな技術が開発されました。しかしながら、示差超遠心、限外濾過、ポリマーベースの沈殿、免疫親和性捕捉、およびマイクロ流体?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
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Materials
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
Riferimenti
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