Um Método Simples de Filtração de Bancada para Isolar Pequenas Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Humanas
Summary
Este protocolo demonstra como isolar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs) com uma configuração simples de bancada em escala laboratorial. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores de sEVs e morfologia de hUC-MSC-sEVs isolados são caracterizados por análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente.
Abstract
O processo baseado em ultracentrifugação é considerado o método comum para o isolamento de pequenas vesículas extracelulares (EVs). No entanto, o rendimento desse método de isolamento é relativamente menor, e esses métodos são ineficientes na separação dos subtipos de sEV. Este estudo demonstra um método simples de filtração de bancada para isolar pequenas vesículas extracelulares de CTM derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs), separadas com sucesso por ultrafiltração do meio condicionado de hUC-MSCs. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores exossômicos (CD9, CD81, TSG101) e morfologia dos hUC-MSC-sEVs isolados foram caracterizados com análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente. O tamanho das hUC-MSC-sEVs isoladas foi de 30-200 nm, com concentração de partículas de 7,75 × 10 10 partículas/mL e concentração proteica de80 μg/mL. Bandas positivas para os marcadores exossômicos CD9, CD81 e TSG101 foram observadas. Este estudo mostrou que hUC-MSC-sEVs foram isolados com sucesso do meio condicionado hUC-MSCs, e a caracterização mostrou que o produto isolado preencheu os critérios mencionados pelo Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Introduction
De acordo com o MISEV 2018, sEVs são partículas de bicamada lipídica não replicantes sem núcleo funcional presente, com um tamanho de 30-200 nm1. Os sEVs derivados de CTM contêm moléculas sinalizadoras importantes que desempenham papéis importantes na regeneração tecidual, como microRNA, citocinas ou proteínas. Eles têm se tornado cada vez mais um “hotspot” de pesquisa em medicina regenerativa e terapia livre de células. Muitos estudos têm demonstrado que as EVs derivadas das CTM são tão eficazes quanto as CTMs no tratamento de diferentes condições, como imunomodulação2,3,4,5, potencialização da osteogênese6, diabetes mellitus7,8ou regeneração vascular9,10. À medida que os ensaios de fase inicial avançam, três questões-chave principais em relação à tradução clínica das CTMs-EVs têm sido destacadas: o rendimento dos EVs, a pureza dos EVs (livres de restos celulares e outros contaminantes biológicos, como proteínas e citocinas) e a integridade da membrana bicamada fosfolipídica dos EVs após o isolamento.
Vários métodos têm sido desenvolvidos para isolar os sEVs, explorando a densidade, forma, tamanho e proteína de superfície dos sEVs11. Os dois métodos mais comuns em isolamentos de sEVs são técnicas baseadas em ultracentrifugação e técnicas baseadas em ultrafiltração.
Métodos baseados em ultracentrifugação são considerados métodos padrão-ouro no isolamento de sEVs. Dois tipos de técnicas de ultracentrifugação que são usualmente empregadas são a ultracentrifugação diferencial e a ultracentrifugação por gradiente de densidade. No entanto, os métodos de ultracentrifugação frequentemente resultam em baixo rendimento e requerem equipamentos caros para ultracentrifugação de alta velocidade (100.000-200.000 × g)11. Além disso, as técnicas de ultracentrifugação isoladamente são ineficientes na separação dos subtipos de EV (sEVs e grandes EVs), resultando em uma camada de sedimento impura11. Por fim, a ultracentrifugação por gradiente de densidade também pode ser demorada e exigir precauções adicionais, como a adição de tampão de sacarose para inibir o dano do gradiente durante as etapas de aceleração e desaceleração12. Assim, a ultracentrifugação geralmente leva a um rendimento relativamente baixo e não é capaz de discriminar diferentes populações de EVs13, o que limita sua aplicação para a preparação em larga escala de EV11.
O segundo método de isolamento de EV é via ultrafiltração, que é baseada na filtração de tamanho. A ultrafiltração é relativamente eficaz em termos de tempo e custo em comparação com a ultracentrifugação, pois não envolve equipamentos caros ou longos tempos de processamento14. Assim, a ultrafiltração parece ser uma técnica de isolamento mais eficaz do que os dois métodos de ultracentrifugação já mencionados. Os produtos isolados podem ser mais específicos com base no tamanho dos poros e maior rendimento15. No entanto, a força adicional incorrida durante o processo de filtração pode resultar na deformação ou erupção dos EVs16.
O presente artigo propôs um protocolo de bancada custo-efetivo e tempo-efetivo para isolar sEVs derivadas de CTM para análise a jusante e fins terapêuticos. O método descrito neste artigo combinou um método de filtração simples com centrifugação de bancada para isolar EVs de alto rendimento e boa qualidade de hUC-MSCs para análise a jusante, incluindo análise de tamanho de partículas, ensaio de biomarcadores e imagens por microscopia eletrônica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os EVs são um dos subgrupos importantes do secretoma nas CTMs que desempenham um papel crucial durante processos normais e patológicos. No entanto, os sEVs, com uma faixa de tamanho entre 30 e 200 nm, surgiram como uma ferramenta potencial para terapia livre de células na última década. Várias técnicas foram desenvolvidas para isolar sEVs de CTMs. Entretanto, ultracentrifugação diferencial, ultrafiltração, precipitação à base de polímero, captura de imunoafinidade e precipitação baseada em microfluídica…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A publicação deste vídeo foi apoiada por My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
Riferimenti
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. . Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Wei, Y., et al. . Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
