Bestämning av tarmpermeabilitet med Lucifer Yellow i en apikal-out enteroidmodell
Summary
Det nuvarande protokollet beskriver en metod som använder lucifergul i en apikal-out enteroidmodell för att bestämma tarmpermeabilitet. Denna metod kan användas för att bestämma paracellulär permeabilitet i enteroider som modellerar inflammatoriska tarmsjukdomar såsom nekrotiserande enterokolit.
Abstract
Enteroider är ett framväxande forskningsverktyg i studien av inflammatoriska tarmsjukdomar som nekrotiserande enterokolit (NEC). De odlas traditionellt i basolateral-out (BO) konformationen, där epitelcellens apikala yta vetter mot den inre lumen. I denna modell är tillgången till enteroidernas luminala yta för behandling och experiment utmanande, vilket begränsar förmågan att studera värd-patogeninteraktioner. För att kringgå detta skapades en neonatal apical-out (AO) modell för nekrotiserande enterokolit. Eftersom tarmepitelcellpermeabilitetsförändringar är patognomoniska för NEC, skisserar detta protokoll med lucifergul (LY) som en markör för paracellulär permeabilitet. LY passerar tarmepitelbarriären via alla tre stora paracellulära vägar: por, läckage och obegränsad. Att använda LY i en AO-modell möjliggör en bredare studie av permeabilitet i NEC. Efter IRB-godkännande och föräldrarnas samtycke samlades kirurgiska prover av tarmvävnad in från mänskliga för tidigt födda barn. Tarmstamceller skördades via kryptisolering och användes för att odla enteroider. Enteroider odlades till mognad och omvandlades sedan AO eller lämnades i BO-konformation. Dessa behandlades antingen inte (kontroll) eller behandlades med lipopolysackarid (LPS) och utsattes för hypoxiska tillstånd för induktion av in vitro NEC. LY användes för att bedöma permeabilitet. Immunofluorescerande färgning av det apikala proteinet zonula occludens-1 och basolateralt protein β-cateninbekräftad AO-konformation. Både AO- och BO-enteroider behandlade med LPS och hypoxi visade signifikant ökad paracellulär permeabilitet jämfört med kontroller. Både AO- och BO-enteroider visade ökat upptag av LY i lumen hos de behandlade enteroiderna jämfört med kontroller. Användningen av LY i en AO-enteroidmodell möjliggör undersökning av alla tre huvudvägarna för paracellulär permeabilitet. Det möjliggör dessutom undersökning av värd-patogeninteraktioner och hur detta kan påverka permeabiliteten jämfört med BO-enteroidmodellen.
Introduction
Enteroider är tredimensionella (3D) strukturer härledda från organbegränsade mänskliga tarmstamceller 1,2. De består helt av epitelial härstamning och innehåller alla differentierade tarmepitelcelltyper2. Enteroider upprätthåller också cellulär polaritet som består av en apikal luminal yta som bildar ett inre fack och en basolateral yta som vetter mot det omgivande mediet. Enteroider är en unik modell genom att de bevarar egenskaperna hos värden från vilken de genererades3. Således representerar enteroider som genereras från för tidigt födda barn en modell som är användbar för att undersöka sjukdomar som främst påverkar denna befolkning, såsom nekrotiserande enterokolit (NEC).
Den traditionella enteroidmodellen odlas i en basolateral-out (BO) konformation, där enteroiden är innesluten i en kupol av källarmembranmatris (BMM). BMM inducerar enteroiden att upprätthålla en 3D-struktur med den basolaterala ytan på utsidan. BO-enteroider är en lämplig modell för NEC som överbryggar klyftan mellan tvådimensionella (2D) primära mänskliga cellinjer och in vivo djurmodeller 2,4. NEC induceras i enteroider genom att placera patogener såsom LPS eller bakterier i media som omger enteroiderna, följt av exponering för hypoxiska tillstånd 2,3. Utmaningen med BO enteroid NEC-modellen är att den inte möjliggör en effektiv studie av värd-patogeninteraktioner, som uppträder vid den apikala ytan in vivo. Förändringar i tarmpermeabilitet beror på dessa värd-patogeninteraktioner. För att bättre förstå hur permeabilitet påverkar den patofysiologiska grunden för sjukdom måste en modell skapas som innebär att man behandlar den apikala ytan.
var de första som visade att mogna BO-enteroider kan induceras att bilda en apikal-out (AO) konformation genom att ta bort BMM-kupolerna och återsuspendera dem i media5. Denna artikel visade att AO-enteroider upprätthöll korrekt epitelpolaritet, innehöll alla tarmcellstyper, upprätthöll tarmepitelbarriären och tillät tillgång till den apikala ytan5. Genom att använda AO-enteroider som NEC-modell uppnås en fysiologisk reproduktion av sjukdomsprocessen och studier av värd-patogeninteraktioner.
En viktig bidragsgivare till patofysiologin hos NEC är ökad tarmpermeabilitet6. Flera molekyler har föreslagits som ett sätt att testa för tarmpermeabilitet in vitro7. Bland dessa är lucifergul (LY) ett hydrofilt färgämne med excitations- och emissionstoppar vid 428 nm respektive540 nm 8. När den korsar genom alla större paracellulära vägar har den använts för att utvärdera paracellulär permeabilitet i olika applikationer, inklusive blod-hjärn- och tarmepitelbarriärerna 8,9. Den traditionella tillämpningen av LY använder celler som odlas i monolager på en halvgenomsläpplig yta10. LY appliceras på den apikala ytan och korsar genom paracellulära täta korsningsproteiner för att samlas på den basolaterala sidan. Högre LY-koncentrationer i det basolaterala facket indikerar minskade täta korsningsproteiner med efterföljande nedbrytning av tarmepitelcellbarriären och ökad permeabilitet10. Det har också beskrivits i 3D BO-enteroidmodeller där LY lades till i media och enskilda enteroider avbildades för upptag av LY i lumen11. Även om detta möjliggör kvalitativ analys via visualisering av LY-upptag, är kvantitativ analys begränsad. Detta protokoll beskriver en unik teknik som använder LY för att bedöma paracellulär permeabilitet med hjälp av en in vitro NEC-enteroidmodell i AO-enteroider samtidigt som 3D-orientering bibehålls. Denna metod kan användas för både kvalitativ och kvantitativ analys av permeabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tartarmpermeabilitet är komplex och reflekterar epitelbarriärfunktionen. Tarmbarriären består av ett enda lager epitelceller som förmedlar transcellulär och paracellulär transport14. Paracellulär permeabilitet är beroende av täta korsningsproteiner som tätar utrymmet mellan epitelceller14. Inom denna paracellulära transport finns det tre distinkta vägar genom vilka molekyler kan korsa: por, läckage ochobegränsad 15. Porvägen möjligg?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Ashley Nelson från University of Rochester Medical Center för hennes instrumentella hjälp med vår enteroidmodell. Vi vill också tacka avdelningen för pediatrisk kirurgi vid University of Oklahoma för deras stöd till detta projekt. Detta arbete stöddes av National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research och Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 som tilldelades institutionen för kirurgi vid University of Oklahoma Health Sciences Center.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow – A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
