Определение кишечной проницаемости с помощью люциферного желтого цвета в апикально-аутентоидной модели
Summary
Настоящий протокол описывает метод, который использует желтый люцифер в апикально-энтероидной модели для определения кишечной проницаемости. Этот метод может быть использован для определения параклеточной проницаемости у энтероидов, которые моделируют воспалительные заболевания кишечника, такие как некротизирующий энтероколит.
Abstract
Энтероиды являются новым исследовательским инструментом в изучении воспалительных заболеваний кишечника, таких как некротизирующий энтероколит (NEC). Они традиционно выращиваются в базолатеральной (BO) конформации, где апикальная поверхность эпителиальной клетки обращена к внутреннему просвету. В этой модели доступ к просветной поверхности энтероидов для лечения и экспериментов является сложной задачей, что ограничивает возможность изучения взаимодействий хозяина и патогена. Чтобы обойти это, была создана неонатальная апикальная модель (AO) для некротизирующего энтероколита. Поскольку изменения проницаемости эпителиальных клеток кишечника являются патогномоничными для NEC, этот протокол описывает использование люциферного желтого (LY) в качестве маркера параклеточной проницаемости. LY пересекает эпителиальный барьер кишечника через все три основных параклеточных пути: поры, утечки и неограниченные. Использование LY в модели AO позволяет более широко изучить проницаемость в NEC. После одобрения IRB и согласия родителей у недоношенных новорожденных человека были взяты хирургические образцы кишечной ткани. Кишечные стволовые клетки были собраны с помощью изоляции крипты и использовались для выращивания энтероидов. Энтероиды выращивали до зрелости, а затем трансформировали АО или оставляли в конформации БО. Их либо не лечили (контроль), либо лечили липополисахаридом (ЛПС) и подвергали гипоксическим состояниям для индукции НЭК in vitro . LY использовался для оценки проницаемости. Иммунофлуоресцентное окрашивание апикального белка zonula occludens-1 и базолатерального белка β-катенина подтвердило конформацию АО. Энтероиды AO и BO, получавшие ЛПС и гипоксию, продемонстрировали значительно повышенную параклеточную проницаемость по сравнению с контрольной группой. Энтероиды AO и BO показали повышенное поглощение LY в просвет обработанных энтероидов по сравнению с контрольной группой. Использование LY в энтероидной модели AO позволяет исследовать все три основных пути параклеточной проницаемости. Это также позволяет исследовать взаимодействия хозяин-патоген и то, как это может повлиять на проницаемость по сравнению с энтероидной моделью BO.
Introduction
Энтероиды представляют собой трехмерные (3D) структуры, полученные из ограниченных органами стволовых клеток кишечника человека 1,2. Они полностью состоят из эпителиальной линии и содержат все дифференцированные типы эпителиальных клеток кишечника2. Энтероиды также поддерживают клеточную полярность, состоящую из апикальной просветной поверхности, образующей внутренний компартмент и базолатеральную поверхность, обращенную к окружающим средам. Энтероиды являются уникальной моделью в том смысле, что они сохраняют характеристики хозяина, из которого они были получены3. Таким образом, энтероиды, полученные от недоношенных человеческих детей, представляют собой модель, которая полезна для исследования заболеваний, которые в первую очередь влияют на эту популяцию, таких как некротизирующий энтероколит (NEC).
Традиционная энтероидная модель выращивается в базолатеральной (BO) конформации, где энтероид заключен в купол базальной мембранной матрицы (BMM). BMM побуждает энтероид поддерживать 3D-структуру с базолатеральной поверхностью снаружи. Энтероиды BO являются подходящей моделью для NEC, которая преодолевает разрыв между двумерными (2D) первичными клеточными линиями человека и in vivo животными моделями 2,4. NEC индуцируется у энтероидов путем размещения патогенов, таких как ЛПС или бактерии, в средах, окружающих энтероиды, с последующим воздействием гипоксических состояний 2,3. Проблема с энтероидной моделью BO NEC заключается в том, что она не позволяет эффективно изучать взаимодействия хозяин-патоген, которые происходят на апикальной поверхности in vivo. Изменения в кишечной проницаемости обусловлены этими взаимодействиями хозяина и патогена. Чтобы лучше понять, как проницаемость влияет на патофизиологическую основу заболевания, необходимо создать модель, которая включает в себя обработку апикальной поверхности.
Co et al. были первыми, кто продемонстрировал, что зрелые энтероиды BO могут быть индуцированы для формирования апикальной (AO) конформации путем удаления куполов BMM и повторного использования их в среде5. Эта статья продемонстрировала, что энтероиды АО поддерживали правильную эпителиальную полярность, содержали все типы клеток кишечника, поддерживали кишечный эпителиальный барьер и обеспечивали доступ к апикальной поверхности5. Использование энтероидов АО в качестве модели НЭК обеспечивает физиологическое воспроизведение процесса заболевания и изучение взаимодействий хозяин-патоген.
Одним из основных факторов, влияющих на патофизиологию НЭК, является повышенная кишечная проницаемость6. Несколько молекул были предложены в качестве способа проверки кишечной проницаемости in vitro7. Среди них люцифер желтый (LY) представляет собой гидрофильный краситель с пиками возбуждения и излучения при 428 нм и 540 нм соответственно8. Поскольку он пересекает все основные параклеточные пути, он был использован для оценки параклеточной проницаемости в различных приложениях, включая гематоэнцефалические и кишечные эпителиальные барьеры 8,9. Традиционное применение LY использует клетки, выращенные в монослоях на полупроницаемой поверхности10. LY наносится на поверхность апикального сустава и пересекает параклеточные плотные соединительные белки, чтобы собраться на базолатеральной стороне. Более высокие концентрации LY в базолатеральном компартменте указывают на снижение плотного соединения белков с последующим разрушением барьера эпителиальных клеток кишечника и повышением проницаемости10. Он также был описан в энтероидных моделях 3D BO, где LY был добавлен в среду, а отдельные энтероиды были изображены для поглощения LY в просвет11. Хотя это позволяет проводить качественный анализ с помощью визуализации поглощения LY, количественный анализ ограничен. Этот протокол описывает уникальную технику, которая использует LY для оценки параклеточной проницаемости с использованием энтероидной модели IN vitro NEC в энтероидах AO при сохранении 3D-ориентации. Этот метод может быть использован как для качественного, так и для количественного анализа проницаемости.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кишечная проницаемость сложна и отражает функцию эпителиального барьера. Кишечный барьер содержит один слой эпителиальных клеток, который опосредует трансклеточный и параклеточный транспорт14. Параклеточная проницаемость зависит от плотного соединения белков, которые ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Эшли Нельсон из Медицинского центра Университета Рочестера за ее инструментальную помощь с нашей энтероидной моделью. Мы также хотели бы поблагодарить отделение детской хирургии Университета Оклахомы за поддержку этого проекта. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Оклахомским центром исследований стволовых клеток для взрослых и грантом Пресвитерианского фонда здоровья No 20180587 присужден департаменту хирургии в Центре медицинских наук Университета Оклахомы.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow – A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
