Détermination de la perméabilité intestinale à l’aide du jaune de Lucifer dans un modèle entéroïde apical-out
Summary
Le présent protocole décrit une méthode qui utilise le jaune de lucifer dans un modèle entéroïde apical-out pour déterminer la perméabilité intestinale. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer la perméabilité paracellulaire chez les entéroïdes qui modélisent les maladies inflammatoires de l’intestin telles que l’entérocolite nécrosante.
Abstract
Les entéroïdes sont un outil de recherche émergent dans l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin telles que l’entérocolite nécrosante (ECN). Ils sont traditionnellement cultivés dans la conformation basolatérale (BO), où la surface apicale de la cellule épithéliale fait face à la lumière interne. Dans ce modèle, l’accès à la surface luminale des entéroïdes pour le traitement et l’expérimentation est difficile, ce qui limite la capacité d’étudier les interactions hôte-pathogène. Pour contourner ce problème, un modèle néonatal apical-out (OA) pour l’entérocolite nécrosante a été créé. Étant donné que les changements de perméabilité des cellules épithéliales intestinales sont pathognomoniques pour l’ECN, ce protocole décrit l’utilisation du jaune de lucifer (LY) comme marqueur de la perméabilité paracellulaire. LY traverse la barrière épithéliale intestinale par les trois principales voies paracellulaires: pore, fuite et sans restriction. L’utilisation de LY dans un modèle AO permet une étude plus large de la perméabilité dans NEC. À la suite de l’approbation de la CISR et du consentement parental, des échantillons chirurgicaux de tissu intestinal ont été prélevés sur des nouveau-nés prématurés humains. Les cellules souches intestinales ont été récoltées par isolement de crypte et utilisées pour cultiver des entéroïdes. Les entéroïdes ont été cultivés jusqu’à maturité, puis transformés AO ou laissés en conformation BO. Ceux-ci n’ont pas été traités (témoins) ou ont été traités avec du lipopolysaccharide (LPS) et soumis à des conditions hypoxiques pour l’induction d’ECN in vitro . La LY a été utilisée pour évaluer la perméabilité. La coloration immunofluorescente de la protéine apicale zonula occludens-1 et de la protéine basolatérale β-caténine a confirmé la conformation de l’AO. Les entéroïdes AO et BO traités avec du LPS et de l’hypoxie ont démontré une perméabilité paracellulaire significativement accrue par rapport aux témoins. Les entéroïdes OA et BO ont montré une absorption accrue de LY dans la lumière des entéroïdes traités par rapport aux témoins. L’utilisation de la LY dans un modèle entéroïde AO permet d’étudier les trois principales voies de perméabilité paracellulaire. Il permet également d’étudier les interactions hôte-pathogène et comment cela peut affecter la perméabilité par rapport au modèle entéroïde BO.
Introduction
Les entéroïdes sont des structures tridimensionnelles (3D) dérivées de cellules souches intestinales humainesrestreintes aux organes 1,2. Ils sont entièrement constitués de lignée épithéliale et contiennent tous les types de cellules épithéliales intestinales différenciées2. Les entéroïdes maintiennent également la polarité cellulaire composée d’une surface luminale apicale formant un compartiment interne et d’une surface basolatérale faisant face au milieu environnant. Les entéroïdes sont un modèle unique en ce sens qu’ils préservent les caractéristiques de l’hôte à partir duquel ils ont été générés3. Ainsi, les entéroïdes générés à partir de nourrissons humains prématurés représentent un modèle utile pour étudier les maladies qui touchent principalement cette population, telles que l’entérocolite nécrosante (ECN).
Le modèle entéroïde traditionnel est cultivé dans une conformation basolatérale (BO), où l’entéroïde est enfermé dans un dôme de matrice membranaire basale (BMM). BMM induit l’entéroïde à maintenir une structure 3D avec la surface basolatérale à l’extérieur. Les entéroïdes BO sont un modèle approprié pour l’ECN qui comble l’écart entre les lignées cellulaires humaines primaires bidimensionnelles (2D) et les modèles animaux in vivo 2,4. L’ECN est induite chez les entéroïdes en plaçant des agents pathogènes tels que le LPS ou les bactéries dans le milieu entourant les entéroïdes, suivie d’une exposition à des conditions hypoxiques 2,3. Le défi avec le modèle NEC entéroïde BO est qu’il ne permet pas l’étude efficace des interactions hôte-pathogène, qui se produisent à la surface apicale in vivo. Les changements dans la perméabilité intestinale sont dus à ces interactions hôte-pathogène. Pour mieux comprendre comment la perméabilité affecte la base physiopathologique de la maladie, il faut créer un modèle qui implique le traitement de la surface apicale.
Co et al. ont été les premiers à démontrer que les entéroïdes BO matures peuvent être induits à former une conformation apicale-out (AO) en retirant les dômes BMM et en les remettant en suspension dans le milieu5. Cet article a démontré que les entéroïdes AO maintenaient une polarité épithéliale correcte, contenaient tous les types de cellules intestinales, maintenaient la barrière épithéliale intestinale et permettaient l’accès à la surface apicale5. L’utilisation des entéroïdes AO comme modèle NEC permet une reproduction physiologique du processus pathologique et l’étude des interactions hôte-pathogène.
L’un des principaux contributeurs à la physiopathologie de l’ECN est l’augmentation de la perméabilité intestinale6. Plusieurs molécules ont été proposées comme moyen de tester la perméabilité intestinale in vitro7. Parmi ceux-ci, le jaune de lucifer (LY) est un colorant hydrophile avec des pics d’excitation et d’émission à 428 nm et 540 nm, respectivement8. Comme il traverse toutes les principales voies paracellulaires, il a été utilisé pour évaluer la perméabilité paracellulaire dans diverses applications, y compris les barrières hémato-encéphalique et intestinale 8,9. L’application traditionnelle de LY utilise des cellules cultivées en monocouches sur une surface semi-perméable10. LY est appliqué sur la surface apicale et traverse les protéines de jonction serrée paracellulaire pour se rassembler sur le côté basolatéral. Des concentrations plus élevées de LY dans le compartiment basolatéral indiquent une diminution des protéines de jonction serrée avec une dégradation subséquente de la barrière cellulaire épithéliale intestinale et une perméabilité accrue10. Il a également été décrit dans des modèles entéroïdes BO 3D où la LY a été ajoutée au milieu et les entéroïdes individuels ont été imagés pour l’absorption de LY dans la lumière11. Bien que cela permette une analyse qualitative via la visualisation de l’absorption des LEI, l’analyse quantitative est limitée. Ce protocole décrit une technique unique qui utilise la LY pour évaluer la perméabilité paracellulaire à l’aide d’un modèle entéroïde NEC in vitro chez les entéroïdes AO tout en maintenant l’orientation 3D. Cette méthode peut être utilisée pour l’analyse qualitative et quantitative de la perméabilité.
Protocol
Representative Results
Discussion
La perméabilité intestinale est complexe et reflète la fonction de barrière épithéliale. La barrière intestinale comprend une seule couche de cellules épithéliales qui intervient dans le transport transcellulaire et paracellulaire14. La perméabilité paracellulaire repose sur des protéines de jonction serrée qui scellent l’espace entre les cellules épithéliales14. Dans ce transport paracellulaire, il existe trois voies distinctes par lesquelles les molécule…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Ashley Nelson du centre médical de l’Université de Rochester pour son aide instrumentale avec notre modèle entéroïde. Nous tenons également à remercier la Division de chirurgie pédiatrique de l’Université de l’Oklahoma pour son soutien à ce projet. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], l’Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research et le Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 attribué au département de chirurgie du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow – A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
