Determinazione della permeabilità intestinale utilizzando Lucifer Yellow in un modello enteroide apical-out
Summary
Il presente protocollo delinea un metodo che utilizza il giallo lucifero in un modello enteroide apical-out per determinare la permeabilità intestinale. Questo metodo può essere utilizzato per determinare la permeabilità paracellulare negli enteroidi che modellano le malattie infiammatorie intestinali come l’enterocolite necrotizzante.
Abstract
Gli enteroidi sono uno strumento di ricerca emergente nello studio delle malattie infiammatorie intestinali come l’enterocolite necrotizzante (NEC). Sono tradizionalmente coltivati nella conformazione basolaterale-out (BO), dove la superficie apicale della cellula epiteliale è rivolta verso il lume interno. In questo modello, l’accesso alla superficie luminale degli enteroidi per il trattamento e la sperimentazione è impegnativo, il che limita la capacità di studiare le interazioni ospite-patogeno. Per aggirare questo, è stato creato un modello apical-out (AO) neonatale per l’enterocolite necrotizzante. Poiché i cambiamenti di permeabilità delle cellule epiteliali intestinali sono patognomonici per NEC, questo protocollo delinea l’uso del giallo lucifero (LY) come marker di permeabilità paracellulare. LY attraversa la barriera epiteliale intestinale attraverso tutte e tre le principali vie paracellulari: poro, perdita e senza restrizioni. L’utilizzo di LY in un modello AO consente uno studio più ampio della permeabilità in NEC. Dopo l’approvazione dell’IRB e il consenso dei genitori, sono stati raccolti campioni chirurgici di tessuto intestinale da neonati pretermine umani. Le cellule staminali intestinali sono state raccolte tramite isolamento della cripta e utilizzate per far crescere enteroidi. Gli enteroidi sono stati coltivati fino alla maturità e poi trasformati AO o lasciati in conformazione BO. Questi non sono stati trattati (controllo) o sono stati trattati con lipopolisaccaride (LPS) e sottoposti a condizioni ipossiche per l’induzione di NEC in vitro . LY è stato utilizzato per valutare la permeabilità. La colorazione immunofluorescente della proteina apicale zonula occludens-1 e della proteina basolaterale β-catenina ha confermato la conformazione AO. Sia gli enteroidi AO che BO trattati con LPS e ipossia hanno dimostrato un aumento significativo della permeabilità paracellulare rispetto ai controlli. Entrambi gli enteroidi AO e BO hanno mostrato un maggiore assorbimento di LY nel lume degli enteroidi trattati rispetto ai controlli. L’utilizzo di LY in un modello enteroide AO consente lo studio di tutte e tre le principali vie di permeabilità paracellulare. Consente inoltre lo studio delle interazioni ospite-patogeno e di come ciò possa influenzare la permeabilità rispetto al modello enteroide BO.
Introduction
Gli enteroidi sono strutture tridimensionali (3D) derivate da cellule staminali intestinali umane limitate all’organo 1,2. Sono costituiti interamente da linee epiteliali e contengono tutti i tipi di cellule epiteliali intestinali differenziate2. Gli enteroidi mantengono anche la polarità cellulare costituita da una superficie luminale apicale che forma un compartimento interno e una superficie basolaterale rivolta verso il mezzo circostante. Gli enteroidi sono un modello unico in quanto preservano le caratteristiche dell’ospite da cui sono stati generati3. Pertanto, gli enteroidi generati da neonati umani prematuri rappresentano un modello utile per studiare le malattie che colpiscono principalmente questa popolazione, come l’enterocolite necrotizzante (NEC).
Il modello enteroide tradizionale viene coltivato in una conformazione basolaterale-out (BO), dove l’enteroide è racchiuso in una cupola di matrice di membrana basale (BMM). BMM induce l’enteroide a mantenere una struttura 3D con la superficie basolaterale all’esterno. Gli enteroidi BO sono un modello adatto per NEC che colma il divario tra le linee cellulari umane primarie bidimensionali (2D) e i modelli animali in vivo 2,4. NEC è indotta negli enteroidi inserendo agenti patogeni come LPS o batteri nei mezzi che circondano gli enteroidi, seguita dall’esposizione a condizioni ipossiche 2,3. La sfida con il modello NEC enteroide BO è che non consente lo studio efficace delle interazioni ospite-patogeno, che si verificano sulla superficie apicale in vivo. I cambiamenti nella permeabilità intestinale sono dovuti a queste interazioni ospite-patogeno. Per comprendere meglio come la permeabilità influisce sulle basi fisiopatologiche della malattia, è necessario creare un modello che preveda il trattamento della superficie apicale.
Co et al. sono stati i primi a dimostrare che gli enteroidi BO maturi possono essere indotti a formare una conformazione apical-out (AO) rimuovendo le cupole BMM e risospendendole in media5. Questo articolo ha dimostrato che gli enteroidi AO mantenevano la corretta polarità epiteliale, contenevano tutti i tipi di cellule intestinali, sostenevano la barriera epiteliale intestinale e consentivano l’accesso alla superficie apicale5. L’utilizzo di enteroidi AO come modello NEC consente di ottenere una riproduzione fisiologica del processo patologico e lo studio delle interazioni ospite-patogeno.
Uno dei principali contributi alla fisiopatologia della NEC è l’aumento della permeabilità intestinale6. Diverse molecole sono state proposte come un modo per testare la permeabilità intestinale in vitro7. Tra questi, il giallo lucifero (LY) è un colorante idrofilo con picchi di eccitazione ed emissione a 428 nm e 540 nm, rispettivamente8. Mentre attraversa tutte le principali vie paracellulari, è stato utilizzato per valutare la permeabilità paracellulare in varie applicazioni, tra cui le barriere epiteliali emato-encefaliche e intestinali 8,9. L’applicazione tradizionale di LY utilizza cellule coltivate in monostrati su una superficie semipermeabile10. LY viene applicato sulla superficie apicale e attraversa attraverso proteine paracellulari a giunzione stretta per riunirsi sul lato basolaterale. Concentrazioni più elevate di LY nel compartimento basolaterale indicano una diminuzione delle proteine a giunzione stretta con conseguente rottura della barriera cellulare epiteliale intestinale e aumento della permeabilità10. È stato anche descritto in modelli enteroidi BO 3D in cui LY è stato aggiunto al supporto e singoli enteroidi sono stati ripresi per l’assorbimento di LY nel lume11. Sebbene ciò consenta l’analisi qualitativa tramite la visualizzazione dell’assorbimento di LY, l’analisi quantitativa è limitata. Questo protocollo delinea una tecnica unica che utilizza LY per valutare la permeabilità paracellulare utilizzando un modello enteroide NEC in vitro in enteroidi AO mantenendo l’orientamento 3D. Questo metodo può essere utilizzato per l’analisi sia qualitativa che quantitativa della permeabilità.
Protocol
Representative Results
Discussion
La permeabilità intestinale è complessa e riflette la funzione della barriera epiteliale. La barriera intestinale comprende un singolo strato di cellule epiteliali che media il trasporto transcellulare e paracellulare14. La permeabilità paracellulare si basa su proteine a giunzione stretta che sigillano lo spazio tra le cellule epiteliali14. All’interno di questo trasporto paracellulare, ci sono tre percorsi distinti attraverso i quali le molecole possono attraversarsi: …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Ashley Nelson dell’Università di Rochester Medical Center per il suo aiuto strumentale con il nostro modello enteroide. Vorremmo anche ringraziare la Divisione di Chirurgia Pediatrica dell’Università dell’Oklahoma per il loro sostegno a questo progetto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], dall’Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research e dal Presbyterian Health Foundation Grant # 20180587 assegnato al Dipartimento di Chirurgia presso l’Università dell’Oklahoma Health Sciences Center.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
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