Determinando a permeabilidade intestinal usando o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out
Summary
O presente protocolo descreve um método que utiliza o amarelo lúcifer em um modelo enteróide apical-out para determinar a permeabilidade intestinal. Este método pode ser usado para determinar a permeabilidade paracelular em enteróides que modelam doenças inflamatórias intestinais, como enterocolite necrosante.
Abstract
Os enteróides são uma ferramenta de pesquisa emergente no estudo de doenças inflamatórias intestinais, como a enterocolite necrosante (NEC). Eles são tradicionalmente cultivados na conformação basolateral-out (BO), onde a superfície apical da célula epitelial está voltada para o lúmen interno. Nesse modelo, o acesso à superfície luminal dos enteroides para tratamento e experimentação é desafiador, o que limita a capacidade de estudar as interações hospedeiro-patógeno. Para contornar isso, foi criado um modelo apical-out neonatal (AO) para enterocolite necrosante. Uma vez que as alterações da permeabilidade das células epiteliais intestinais são patognomônicas para a NEC, este protocolo descreve o uso do amarelo lucifer (LY) como marcador de permeabilidade paracelular. O LY atravessa a barreira epitelial intestinal através de todas as três principais vias paracelulares: poros, vazamento e irrestrito. O uso de LY em um modelo AO permite um estudo mais amplo da permeabilidade em NEC. Após a aprovação do IRB e o consentimento dos pais, amostras cirúrgicas de tecido intestinal foram coletadas de recém-nascidos prematuros humanos. As células-tronco intestinais foram colhidas via isolamento de criptas e usadas para cultivar enteróides. Os enteróides foram cultivados até a maturidade e, em seguida, transformados AO ou deixados em conformação BO. Estes não foram tratados (controle) ou foram tratados com lipopolissacarídeo (LPS) e submetidos a condições hipóxicas para a indução de NEC in vitro . O LY foi utilizado para avaliar a permeabilidade. A coloração imunofluorescente da proteína apical zonula occludens-1 e da proteína basolateral β-catenina confirmou a conformação da AO. Os enteróides AO e BO tratados com LPS e hipóxia demonstraram um aumento significativo da permeabilidade paracelular em comparação com os controles. Ambos os enteróides AO e BO mostraram aumento da absorção de LY no lúmen dos enteróides tratados em comparação com os controles. A utilização de LY em um modelo enteróide AO permite a investigação de todas as três principais vias de permeabilidade paracelular. Além disso, permite a investigação das interações hospedeiro-patógeno e como isso pode afetar a permeabilidade em comparação com o modelo enteróide BO.
Introduction
Os enteroides são estruturas tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco intestinais humanas com restrição de órgãos 1,2. Eles são compostos inteiramente de linhagem epitelial e contêm todos os tipos diferenciados de células epiteliais intestinais2. Os enteróides também mantêm a polaridade celular composta por uma superfície luminal apical formando um compartimento interno e uma superfície basolateral voltada para o meio circundante. Os enteróides são um modelo único na medida em que preservam as características do hospedeiro a partir do qual foram gerados3. Assim, os enteroides gerados a partir de prematuros humanos representam um modelo útil para a investigação de doenças que acometem principalmente essa população, como a enterocolite necrosante (NEC).
O modelo enteróide tradicional é cultivado em uma conformação basolateral-out (BO), onde o enteróide é envolto em uma cúpula de matriz de membrana basal (BMM). A BMM induz o enteróide a manter uma estrutura 3D com a superfície basolateral do lado de fora. Os enteróides BO são um modelo adequado para NEC que preenche a lacuna entre linhagens celulares humanas primárias bidimensionais (2D) e modelos animais in vivo 2,4. A NEC é induzida em enteroides pela colocação de patógenos como LPS ou bactérias no meio ao redor dos enteroides, seguida de exposição a condições hipóxicas 2,3. O desafio com o modelo NEC enteróide BO é que ele não permite o estudo efetivo das interações hospedeiro-patógeno, que ocorrem na superfície apical in vivo. Alterações na permeabilidade intestinal são devidas a essas interações hospedeiro-patógeno. Para entender melhor como a permeabilidade afeta a base fisiopatológica da doença, um modelo deve ser criado que envolva o tratamento da superfície apical.
Co et al. foram os primeiros a demonstrar que enteroides BO maduros podem ser induzidos a formar uma conformação apical-out (AO) removendo as cúpulas de BMM e ressuspendendo-as em meio5. Este artigo demonstrou que os enteroides AO mantiveram a polaridade epitelial correta, continham todos os tipos de células intestinais, mantinham a barreira epitelial intestinal e permitiam o acesso à superfície apical5. O uso de enteroides AO como um modelo NEC alcança uma reprodução fisiológica do processo da doença e o estudo das interações hospedeiro-patógeno.
Um dos principais contribuintes para a fisiopatologia da NEC é o aumento da permeabilidade intestinal6. Diversas moléculas têm sido propostas como forma de testar a permeabilidade intestinal in vitro7. Dentre estes, o amarelo lúcifer (LY) é um corante hidrofílico com picos de excitação e emissão a 428 nm e 540 nm, respectivamente8. Ao atravessar todas as principais vias paracelulares, tem sido utilizado para avaliar a permeabilidade paracelular em diversas aplicações, incluindo as barreiras hematoencefálicas e epiteliais intestinais 8,9. A aplicação tradicional de LY utiliza células cultivadas em monocamadas sobre uma superfície semipermeável10. O LY é aplicado à superfície apical e atravessa através de proteínas de junção apertada paracelular para se reunir no lado basolateral. Concentrações mais elevadas de LY no compartimento basolateral indicam diminuição das proteínas da junção apertada com subsequente quebra da barreira celular epitelial intestinal e aumento da permeabilidade10. Também foi descrita em modelos enteroides 3D BO onde LY foi adicionado ao meio e enteróides individuais foram fotografados para absorção de LY no lúmen11. Embora isso permita a análise qualitativa através da visualização da absorção de LY, a análise quantitativa é limitada. Este protocolo descreve uma técnica única que usa LY para avaliar a permeabilidade paracelular usando um modelo enteróide NEC in vitro em enteróides AO, mantendo a orientação 3D. Este método pode ser usado para análise qualitativa e quantitativa da permeabilidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
A permeabilidade intestinal é complexa e reflexiva da função de barreira epitelial. A barreira intestinal compreende uma única camada de células epiteliais que medeia o transporte transcelular e paracelular14. A permeabilidade paracelular depende de proteínas de junção apertada que selam o espaço entre as células epiteliais14. Dentro desse transporte paracelular, existem três vias distintas pelas quais as moléculas podem se cruzar: poros, vazamento e irrestrito<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Ashley Nelson, do Centro Médico da Universidade de Rochester, por sua ajuda instrumental com nosso modelo enteróide. Também gostaríamos de agradecer à Divisão de Cirurgia Pediátrica da Universidade de Oklahoma por seu apoio a este projeto. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde [NIH Grant R03 DK117216-01A1], o Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research e o Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 concedido ao Departamento de Cirurgia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow – A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
