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Bioingegneria

인간 관절 연골 외식물에 대한 원자력 현미경 기반 미세 압입의 실제 문제 해결

Published: October 28, 2022
doi:
10.3791/64371
, , ,
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery,University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery,University Hospital Tübingen

Summary

원자력 현미경 미세 압입과 관련된 가장 일반적인 문제를 식별하고 해결하기 위한 단계별 접근 방식을 제시합니다. 우리는 다양한 정도의 골관절염 유발 퇴행을 특징으로 하는 토착 인간 관절 연골 외식에 대한 새로운 문제를 예시합니다.

Abstract

의심할 여지 없이 원자력 현미경(AFM)은 현재 생물학 분야에서 마이크로 및 나노 신호를 평가하는 가장 강력하고 유용한 기술 중 하나입니다. 그러나 다른 미시적 접근 방식과 마찬가지로 방법론적 문제가 발생할 수 있습니다. 특히, 시료의 특성, 시료 전처리, 기기 유형 및 압흔 프로브로 인해 원치 않는 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 건강한 관절염 관절 연골 외식에 대한 이러한 새로운 문제를 예시합니다. 이를 위해 먼저 전체 조직 이식물의 대형 2D 모자이크 형광 이미징을 통해 다양한 변성 단계에 따라 생체 외 관절 연골 디스크를 생성, 등급 지정 및 시각적으로 분류하는 방법을 단계별 접근 방식으로 보여줍니다. ex vivo 모델의 가장 큰 강점은 골관절염 초기 발병부터 진행까지 골관절염 관련 변화를 조사할 수 있는 노화된 천연 인간 연골로 구성되어 있다는 것입니다. 또한 조직 준비의 일반적인 함정과 후속 데이터 분석과 함께 실제 AFM 절차도 제시됩니다. 시료 전처리 및 처리, 고급 변성으로 인한 지형학적 시료 특성, 시료-팁 상호 작용과 같은 기본적이지만 중요한 단계가 데이터 수집에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 보여줍니다. 또한 AFM에서 가장 일반적인 문제를 면밀히 조사하고 가능한 경우 이를 극복하는 방법을 설명합니다. 이러한 한계에 대한 지식은 올바른 데이터 수집, 해석 및 궁극적으로 광범위한 과학적 맥락에 결과를 포함시키는 데 가장 중요합니다.

Introduction

전자 장치 및 시스템의 크기가 계속 줄어들면서 마이크로 및 나노 기반 기술 및 장비의 급속한 발전이 탄력을 받았습니다. 그러한 장치 중 하나는 원자력 현미경 (AFM)으로, 생물학적 표면을 스캔하고 나노 및 마이크로 미터 규모 1,2에서 지형 또는 생체 역학 정보를 검색 할 수 있습니다. 그것의 광대한 특징 중에서, 이 공구는 각종 생물학 체계 3,4,5,6의 기계적 성질에 관하여 정보를 얻기 위하여 마이크로 뿐 아니라 nano indenter로 운영될 수 있다. 데이터는 기계적 프로브를 통해 표면과의 물리적 접촉에 의해 수집되며, 이는 팁7에서 약 1nm만큼 작을 수 있습니다. 샘플의 결과 변형은 캔틸레버 팁의 압흔 깊이와 샘플8에 가해지는 힘을 기반으로 표시됩니다.

골관절염(OA)은 관절과 주변 조직의 관절 연골이 악화되어 뼈 표면이 완전히 노출될 수 있는 장기적인 퇴행성 만성 질환입니다. OA의 부담은 상당합니다. 현재 65세 이상 여성의 절반과 남성의 1/3이 골관절염9을 앓고 있습니다. 외상, 비만, 그리고 그로 인한 관절(10)의 변형된 생체역학이 관절 연골 퇴행을 결정하며, 이는 일반적인 최종 결과로 간주된다. Ganz et al.의 선구적인 연구는 OA 과정의 초기 단계가 연골11의 생체역학적 특성과 관련이 있을 수 있다고 가정했으며, 그 이후로 연구자들은 이 가설을 확인했습니다 12. 마찬가지로, 조직의 생체역학적 특성은 세포-세포 및 세포-기질 누화뿐만 아니라 초구조적 조직에 의해 기능적으로 조정된다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있습니다. 모든 변화는 전체 조직의 생체역학적 기능에 극적인 영향을 미칠 수 있다13. 현재까지 OA 진단은 임상적이며 일반 필름 방사선 촬영을 기반으로 한다14. 이 접근법은 양면성을 가지고 있다: 첫째, 골관절염의 진단을 공식화하기 위한 정의된 퇴행성 컷오프 역치가 없기 때문에 상태를 정량화하기 어렵고, 둘째, 영상 기법은 감도와 표준화가 부족하고 국소 연골 손상을 감지할 수 없다15,16,17. 이를 위해 연골의 기계적 성질 평가는 골관절염의 병인과 무관하게 골관절염 진행 과정에서 변하는 파라미터를 설명하고, 매우 초기 단계에서 조직 기능에 직접적인 영향을 미친다는 결정적인 장점이 있습니다. 압흔 기구는 조직이 압흔에 저항하는 힘을 측정합니다. 사실 이것은 새로운 개념이 아닙니다. 가장 초기의 연구는 1980년대와 1990년대로 거슬러 올라간다. 이 기간 동안 수많은 연구에서 관절 연골의 관절경 측정을 위해 설계된 압흔 기구가 연골의 퇴행성 변화를 감지하는 데 적합할 수 있음을 시사했습니다. 30년 전에도 일부 연구에서는 압흔 기구가 관절경 검사 중 압축 강성 측정을 수행하여 조직 퇴화 중 연골 표면의 생체 내 변화를 감지할 수 있음을 입증할 수 있었습니다18,19,20.

관절 연골의 AFM 압흔(AFM-IT)은 조직의 중추적인 기계적 특성, 즉 강성에 대한 정보를 제공합니다. 이것은 인가된 비파괴 하중과 압입된 조직 영역(21)의 결과적인 변형 사이의 관계를 기술하는 기계적 파라미터이다. AFM-IT는 거시적으로 영향을 받지 않는 콜라겐 네트워크에서 연령에 따른 강성 변화를 정량화할 수 있는 것으로 나타났으며, 따라서 골관절염 발병과 관련된 병리학적 변화(관절 연골의 Outerbridge 척도에서 0등급)를 구별할 수 있습니다22. 우리는 이전에 AFM-IT가 초기 연골 퇴행에 대한 이미지 기반 바이오마커로서 공간 연골 세포 조직을 기반으로 정량화할 뿐만 아니라 실제로 초기 퇴행성 기계적 변화를 정확히 찾아낼 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 발견은 이미 다른 사람들에 의해 확인되었다23,24. 따라서 AFM-IT는 초기 퇴행성 변화를 진단하고 식별하는 흥미로운 도구 역할을 합니다. 이러한 변화는 이미 세포 수준에서 측정될 수 있으며, OA 병태생리학적 과정에 대한 이해를 재구성할 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 천연 연골 외식물 준비부터 AFM 데이터 수집 및 처리에 이르기까지 관절 연골 외식의 완전한 조직학적 및 생체역학적 등급 지정 절차를 보여줍니다. 단계별 접근 방식을 통해 2D 대형 모자이크 이미징 및 마이크로 AFM 압흔을 통해 다양한 퇴행 단계에 따라 관절 연골 조직을 생성, 등급 지정 및 시각적으로 분류하는 방법을 보여줍니다.

현재 AFM-IT는 연골의 생체역학적 변화를 측정하는 가장 민감한 도구 중 하나이지만7 다른 도구 기법과 마찬가지로 잘못된 데이터 수집으로 이어질 수 있는 한계와 실용적인 특성25이 있다. 이를 위해 연골 외출부의 심방세동 측정 중에 발생하는 가장 일반적인 문제를 면밀히 조사하고 가능한 경우 이를 최소화하거나 극복하는 방법을 설명합니다. 여기에는 샘플의 지형적 측면과 AFM 호환 환경에서 안정화하기 어려운 점, 조직 표면의 물리적 특성, 이러한 표면에서 AFM 측정을 수행하는 데 따른 어려움이 포함됩니다. 잘못된 힘-거리 곡선의 예도 제시되어 이를 유발할 수 있는 조건을 강조합니다. 캔틸레버 팁의 형상에 내재된 추가 제한 사항과 데이터 분석을 위한 Hertz 모델 사용도 논의됩니다.

Protocol

독일 튀빙겐 대학병원에서 무릎 인공관절 전치환술을 받은 환자로부터 채취한 대퇴골 과두를 사용했다. 이 연구에는 퇴행성 및 외상 후 관절 병리가 있는 환자의 관절 연골 샘플만 포함되었습니다. 연구 시작 전에 부서, 기관 및 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(프로젝트 번호 674/2016BO2). 참여하기 전에 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 참고: 실험 단계의 시?…

Representative Results

자체 제작한 절단 장치를 사용하여 단일 스트링(SS, 그림 2A), 이중 스트링(DS), 작은 클러스터(SC), 큰 클러스터(BC; 그림 2A) 및 확산(그림 2B). 대표적인 연골 이식은 그림 3A에 묘사되어 있습니다. 한 가지 유형의 패턴만 표시하는 디스크 선택은 하향식 형광 이미징을 사용하여 수행되었습니다(<…

Discussion

진행성 다인성 질환인 골관절염은 관절 연골의 구조적, 기능적 변화를 유발합니다. 골관절염이 진행되는 동안, 기계적 특징의 손상은 관절 연골 표면의 구조적 및 생화학적 변화를 동반한다27,31. 골관절염에서 발생하는 가장 초기의 병리학적 사건은 프로테오글리칸 고갈과 콜라겐 네트워크 붕괴이다32,33,34<su…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

조직 샘플을 제공해 주신 튀빙겐 대학병원 정형외과의 정형외과 의사들에게 감사드립니다.

Materials

Amphotericin B Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head  CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany JPK00518
Biocompatible sample glue  Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany H000033
Calcein AM Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA 14948 Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SAA-SPH-5UM Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device  Self-made  n/a Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope Leica Biosystems, Wetzlar, Germany DFC3000G
Cryotome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany CM3050S 
Data Processing Software for the AFM Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)  Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany 41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8) Leica Biosystems, Wetzlar, Germany 11889113
Glass block cantiliver holder Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany SP-90-05 Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM) AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine  Merck KGaA, Darmstadt, Germany F1315
Microscope glass slides Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS294775X50
Mounting medium With DAPI ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany 50011 Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater) Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany T-05-0117
Scalpel Feather Medical Products, Osaka, Japan 2023-01
Silicone Skirt Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany n/a Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS IBM, Armonk, New York, USA SPSS Statistics 22 Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes  TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands SA6255012 Water-soluble embedding medium 
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Keywords: Articular CartilageOsteoarthritisMicro-indentationAtomic Force MicroscopyCartilage ExplantsBiomechanical PropertiesIn Vitro ModelCartilage DiscFluorescence MicroscopyAFM Calibration
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Daniel, C., Alexander, D., Umrath, F., Danalache, M. Addressing Practical Issues in Atomic Force Microscopy-Based Micro-Indentation on Human Articular Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (188), e64371, doi:10.3791/64371 (2022).
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