Решение практических вопросов микроиндентирования на основе атомно-силовой микроскопии на эксплантах суставного хряща человека

Summary

Представлен пошаговый подход к выявлению и решению наиболее распространенных проблем, связанных с микровдавливаниями в атомно-силовой микроскопии. В качестве примера мы приводим возникающие проблемы на экплантах суставного хряща человека, характеризующихся различными степенями дегенерации, вызванной остеоартритом.

Abstract

Без сомнения, атомно-силовая микроскопия (АСМ) в настоящее время является одним из самых мощных и полезных методов для оценки микро- и даже наносигналов в биологической области. Однако, как и в случае с любым другим микроскопическим подходом, могут возникнуть методологические проблемы. В частности, характеристики образца, пробоподготовки, тип прибора и датчик для индентирования могут привести к появлению нежелательных артефактов. В этом протоколе мы иллюстрируем эти возникающие проблемы на здоровых, а также на костно-артритных эксплантатах суставного хряща. С этой целью мы сначала покажем с помощью пошагового подхода, как генерировать, классифицировать и визуально классифицировать диски суставного хряща ex vivo в соответствии с различными стадиями дегенерации с помощью большой 2D-мозаичной флуоресцентной визуализации всей ткани. Основное преимущество модели ex vivo заключается в том, что она включает в себя старые, естественные хрящи человека, что позволяет исследовать изменения, связанные с остеоартритом, от раннего начала до прогрессирования. Кроме того, представлены общие подводные камни при подготовке тканей, а также сама процедура АСМ вместе с последующим анализом данных. Мы показываем, как основные, но важные этапы, такие как подготовка и обработка образцов, характеристики топографических образцов, вызванные прогрессирующей дегенерацией, и взаимодействие образца с наконечником образца, могут повлиять на сбор данных. Мы также тщательно изучаем наиболее распространенные проблемы в АСМ и описываем, где это возможно, способы их преодоления. Знание этих ограничений имеет первостепенное значение для правильного сбора данных, интерпретации и, в конечном счете, включения полученных результатов в широкий научный контекст.

Introduction

В связи с постоянно уменьшающимися размерами электронных устройств и систем набирает обороты стремительное развитие микро- и нанотехнологий и оборудования. Одним из таких устройств является атомно-силовая микроскопия (АСМ), которая может сканировать биологические поверхности и извлекать топографическую или биомеханическую информацию как в нано-, так и в микрометровом масштабе ^1,2. Среди его обширных возможностей можно отметить, что этот прибор может работать как в микро-, так и в нано-инденторе для получения информации о механических свойствах различных биологических систем 3,4,5,6. Данные собираются путем физического контакта с поверхностью с помощью механического зонда, который может иметь размер около 1 нм на конце⁷. Результирующая деформация образца затем отображается в зависимости от глубины вдавливания консольного наконечника и силы, приложенной к образцу⁸.

Остеоартроз (ОА) – это длительное дегенеративное хроническое заболевание, характеризующееся ухудшением состояния суставного хряща в суставах и окружающих тканей, что может привести к полному обнажению костных поверхностей. Бремя ОД является существенным; В настоящее время половина всех женщин и одна треть всех мужчин в возрасте 65 лет и старше страдают от ОА⁹. Травмы, ожирение и, как следствие, изменение биомеханики сустава¹⁰ определяют дегенерацию суставного хряща, которая рассматривается как общий конечный результат. Новаторское исследование Ganz et al. постулировало, что ранние стадии процесса ОА могут быть связаны с биомеханическими свойствами хряща¹¹, и с тех пор исследователи подтвердили эту гипотезу¹². Кроме того, принято считать, что биомеханические свойства ткани функционально управляются ультраструктурной организацией, а также перекрестными помехами между клетками и клетками-матриксами. Любые изменения могут существенно повлиять на общее биомеханическое функционирование тканей¹³. На сегодняшний день диагноз ОА носит клинический характер и основывается на рентгенографии на обычной пленке¹⁴. Этот подход является двусторонним: во-первых, отсутствие определенного дегенеративного порога отсечения для постановки диагноза ОА затрудняет количественную оценку этого состояния, и, во-вторых, методы визуализации не обладают достаточной чувствительностью и стандартизацией и не могут обнаружить локализованное повреждение хряща^15,16,17. С этой целью оценка механических свойств хряща имеет решающее преимущество в том, что она описывает параметр, который изменяется в течение ОА независимо от этиологии заболевания и оказывает непосредственное влияние на функциональность тканей на самой ранней стадии. Инструменты для индентирования измеряют силу, с которой ткань сопротивляется вдавливанию. Это, на самом деле, не новая концепция; Самые ранние исследования датируются 1980-ми и 1990-ми годами. В этот период многочисленные исследования показали, что инструменты для индентирования, предназначенные для артроскопических измерений суставного хряща, могут быть хорошо приспособлены для обнаружения дегенеративных изменений в хряще. Еще 30 лет назад некоторые исследования смогли продемонстрировать, что инструменты для индентирования способны обнаруживать in vivo изменения поверхности хряща при дегенерации тканей путем проведения измерений компрессионной жесткости во время артроскопии^18,19,20.

АСМ индентирование (АСМ-ИТ) суставного хряща дает информацию об основных механических свойствах ткани, а именно о жесткости. Это механический параметр, описывающий связь между приложенной неразрушающей нагрузкой и результирующей деформацией вдавленной области^{ткани 21}. Было показано, что AFM-IT способна количественно оценивать возрастные изменения жесткости в макроскопически непораженных коллагеновых сетях, таким образом, дифференцировать патологические изменения, связанные с началом ОА (степень 0 по шкале Outerbridge в суставном хряще)²². Ранее мы показали, что АСМ-ИТ на основе пространственной организации хондроцитов в качестве биомаркера ранней дегенерации хряща на основе изображений позволяют не только количественно оценить, но и фактически точно определить самые ранние дегенеративные механические изменения. Эти выводы уже подтверждены другими^23,24. Таким образом, AFM-IT выступает в качестве интересного инструмента для диагностики и выявления ранних дегенеративных изменений. Эти изменения уже могут быть измерены на клеточном уровне, что меняет понимание патофизиологического процесса ОА.

В этом протоколе мы демонстрируем полную процедуру гистологической и биомеханической классификации эксплантов суставного хряща, начиная с подготовки экплантов из нативного хряща и заканчивая сбором и обработкой данных АСМ. С помощью пошагового подхода мы показываем, как генерировать, классифицировать и визуально классифицировать суставную хрящевую ткань в соответствии с различными стадиями дегенерации с помощью 2D-визуализации большой мозаики с последующей микро-АСМ индентацией.

Несмотря на то, что в настоящее время АСМ-ИТ является одним из наиболее чувствительных инструментов для измерения биомеханических изменений в хряще⁷, как и любой другой инструментальный метод, он имеет ограничения и практические особенности²⁵, которые могут привести к ошибочному получению данных. С этой целью мы тщательно рассмотрим наиболее распространенные проблемы, возникающие при АСМ измерениях хрящевых эксплантов, и опишем, где это возможно, способы их минимизации или преодоления. К ним относятся топографические аспекты образцов и трудности их стабилизации в АСМ-совместимой среде, физические особенности поверхности ткани и, как следствие, трудности при проведении АСМ измерений на таких поверхностях. Также приведены примеры ошибочных кривых зависимости силы от расстояния с акцентом на условия, которые могут их вызвать. Также обсуждаются дополнительные ограничения, присущие геометрии консольного наконечника и использованию модели Герца для анализа данных.

Protocol

Использовались мыщелки бедренной кости, собранные у пациентов, перенесших тотальное эндопротезирование коленного сустава в университетской клинике Тюбингена, Германия. В исследование были включены только образцы суставного хряща пациентов с дегенеративными и посттравматическими п…

Representative Results

Используя самодельное режущее устройство, мы смогли эксплантировать и получить небольшие (4 мм х 1 мм) хрящевые диски из свежих мыщелков человека, содержащих единый ячеистый пространственный паттерн30 одиночных нитей (SS, рис. 2A), двойных нитей (DS), малых класте?…

Discussion

Являясь прогрессирующим и многофакторным заболеванием, ОА вызывает структурные и функциональные изменения в суставном хряще. На протяжении всего течения ОА нарушения механических свойств сопровождаются структурными и биохимическими изменениями на поверхности суставного хряща<sup cla…

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium