Abordando Questões Práticas em Micro-Indentação Baseada em Microscopia de Força Atômica em Explantes de Cartilagem Articular Humana

Summary

Apresentamos uma abordagem passo a passo para identificar e abordar os problemas mais comuns associados às micro-indentações por microscopia de força atômica. Exemplificamos os problemas emergentes em explantes de cartilagem articular humana nativa caracterizados por vários graus de degeneração impulsionada pela osteoartrite.

Abstract

Sem dúvida, a microscopia de força atômica (AFM) é atualmente uma das técnicas mais poderosas e úteis para avaliar micro e até mesmo nanopistas no campo biológico. No entanto, como em qualquer outra abordagem microscópica, desafios metodológicos podem surgir. Em particular, as características da amostra, a preparação da amostra, o tipo de instrumento e a sonda de recuo podem levar a artefatos indesejados. Neste protocolo, exemplificamos essas questões emergentes em explantes de cartilagem articular saudável e osteoartrítica. Para isso, primeiramente mostramos, por meio de uma abordagem passo a passo, como gerar, graduar e classificar visualmente discos de cartilagem articular ex vivo de acordo com diferentes estágios de degeneração por meio de imagens de fluorescência em mosaico 2D de todo o tecido explante. A maior força do modelo ex vivo é que ele compreende cartilagem humana envelhecida, nativa, que permite a investigação de alterações relacionadas à osteoartrite desde o início precoce até a progressão. Além disso, armadilhas comuns na preparação tecidual, bem como o procedimento real de AFM juntamente com a análise subsequente dos dados, também são apresentados. Mostramos como etapas básicas, mas cruciais, como preparação e processamento de amostras, características topográficas de amostras causadas por degeneração avançada e interação amostra-ponta podem afetar a aquisição de dados. Também submetemos ao escrutínio os problemas mais comuns no AFM e descrevemos, sempre que possível, como superá-los. O conhecimento dessas limitações é de extrema importância para a correta aquisição, interpretação e, em última análise, incorporação dos achados em um amplo contexto científico.

Introduction

Devido ao tamanho cada vez menor dos dispositivos e sistemas eletrônicos, o rápido desenvolvimento de tecnologia e equipamentos baseados em micro e nano ganhou impulso. Um desses dispositivos é a microscopia de força atômica (AFM), que pode escanear superfícies biológicas e recuperar informações topográficas ou biomecânicas em escalas nano e micrométricas ^1,2. Dentre suas vastas características, essa ferramenta pode ser operada tanto como micro quanto como nano-indenter para obter informações sobre as propriedades mecânicas de diversos sistemas biológicos 3,4,5,6. Os dados são coletados pelo contato físico com a superfície através de uma sonda mecânica, que pode ser tão pequena quanto cerca de 1 nm em sua ponta⁷. A deformação resultante da amostra é então exibida com base na profundidade de indentação da ponta do cantilever e na força aplicada na amostra⁸.

A osteoartrite (OA) é uma doença crônica degenerativa de longa duração caracterizada pela deterioração da cartilagem articular nas articulações e tecidos circundantes, que pode levar à exposição completa das superfícies ósseas. O peso dos AT é substancial; atualmente, metade das mulheres e um terço de todos os homens com 65 anos ou mais sofrem de OA⁹. Traumas, obesidade e a consequente alteração biomecânica da articulação¹⁰ determinam a degeneração da cartilagem articular, que é vista como um resultado final comum. O estudo pioneiro de Ganz e col. postula que os passos iniciais do processo de OA podem envolver as propriedades biomecânicas da cartilagem¹¹ e, desde então, pesquisadores têm confirmado essa hipótese¹². Da mesma forma, é geralmente aceito que as propriedades biomecânicas do tecido são funcionalmente orquestradas pela organização ultraestrutural, bem como pelo crosstalk célula-célula e célula-matriz. Qualquer alteração pode afetar drasticamente o funcionamento biomecânico tecidual como um todo¹³. Até o momento, o diagnóstico da OA é clínico e baseado em radiografias simples¹⁴. Essa abordagem é bilateral: em primeiro lugar, a falta de um limiar de corte degenerativo definido para formular o diagnóstico de OA torna a condição difícil de quantificar e, em segundo lugar, os métodos de imagem carecem de sensibilidade e padronização e não conseguem detectar dano localizado da cartilagem^15,16,17. Para tanto, a avaliação das propriedades mecânicas da cartilagem tem a vantagem decisiva de descrever um parâmetro que se modifica durante o curso da OA, independentemente da etiologia da doença, e tem influência direta na funcionalidade tecidual em estágio muito precoce. Os instrumentos de indentação medem a força pela qual o tecido resiste à indentação. Este não é, de facto, um conceito novo; Os primeiros estudos datam das décadas de 1980 e 1990. Nesse período, numerosos estudos sugeriram que instrumentos de indentação projetados para as medidas artroscópicas da cartilagem articular poderiam ser bem adequados para detectar alterações degenerativas na cartilagem. Há 30 anos, alguns estudos conseguiram demonstrar que instrumentos de indentação eram capazes de detectar in vivo alterações na superfície da cartilagem durante a degeneração tecidual, realizando medidas de rigidez compressiva durante a artroscopia18,19,20.

A indentação de AFM (AFM-IT) da cartilagem articular fornece informações sobre uma propriedade mecânica fundamental do tecido, a rigidez. Trata-se de um parâmetro mecânico que descreve a relação entre uma carga aplicada não destrutiva e a deformação resultante da área de tecido recuada²¹. O AMO-TI mostrou-se capaz de quantificar modificações idade-dependentes na rigidez em redes de colágeno macroscopicamente não afetadas, diferenciando as alterações patológicas associadas ao aparecimento da OA (grau 0 na escala de Outerbridge na cartilagem articular)²². Nós mostramos anteriormente que AFM-ITs, com base na organização espacial dos condrócitos como um biomarcador baseado em imagem para a degeneração precoce da cartilagem, permitem não apenas quantificar, mas também identificar as alterações mecânicas degenerativas mais precoces. Esses achados já foram confirmados por outros^23,24. Assim, o AFM-IT atua como uma ferramenta interessante para diagnosticar e identificar alterações degenerativas precoces. Essas alterações já podem ser medidas em nível celular, remodelando a compreensão do processo fisiopatológico da OA.

Neste protocolo, demonstramos um completo procedimento de graduação histológica e biomecânica dos explantes da cartilagem articular, desde o preparo dos explantes da cartilagem nativa até a aquisição e processamento dos dados de MFA. Através de uma abordagem passo a passo, mostramos como gerar, graduar e classificar visualmente o tecido cartilaginoso articular de acordo com diferentes estágios de degeneração por meio de imagens 2D de mosaico grande, seguidas de micro-AFM.

Embora atualmente o AFM-IT seja uma das ferramentas mais sensíveis para mensurar alterações biomecânicas na^cartilagem7, como qualquer outra técnica instrumental, apresenta limitações e peculiaridades^práticas25 que podem levar à aquisição errônea de dados. Para tanto, submetemos ao exame os problemas mais comuns que surgem durante as medidas de MFA dos explantes cartilaginosos e descrevemos, sempre que possível, como minimizá-los ou superá-los. Estes incluem aspectos topográficos das amostras e as dificuldades para estabilizá-las em um ambiente compatível com AFM, peculiaridades físicas da superfície do tecido e as dificuldades resultantes na realização de medidas de AFM nessas superfícies. Exemplos de curvas força-distância errôneas também são apresentados, enfatizando as condições que podem ocasioná-las. Limitações adicionais inerentes à geometria da ponta do cantilever e ao uso do modelo de Hertz para a análise dos dados também são discutidas.

Protocol

Foram utilizados côndilos femorais coletados de pacientes submetidos à artroplastia total do joelho no Hospital Universitário de Tübingen, Alemanha. Apenas amostras de cartilagem articular de pacientes com patologias articulares degenerativas e pós-traumáticas foram incluídas neste estudo. Antes do início do estudo, foram obtidas aprovações departamentais, institucionais e de comitês de ética locais (Projeto nº 674/2016BO2). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da p…

Representative Results

Usando um dispositivo de corte de fabricação própria, foi possível explantar e gerar discos de cartilagem pequenos (4 mm x 1 mm) a partir de côndilos humanos frescos contendo um padrão espacial celular único30 de cordas simples (SS, Figura 2A), cordas duplas (DS), pequenos aglomerados (SC), grandes aglomerados (BC; Figura 2A) e difusa (Figura 2B). Um explante representativo da cartilagem está represen…

Discussion

Como doença progressiva e multifatorial, a OA desencadeia alterações estruturais e funcionais da cartilagem articular. Ao longo do curso da OA, o comprometimento das características mecânicas é acompanhado por alterações estruturais e bioquímicas na superfície da cartilagem articular ^27,31. Os eventos patológicos mais precoces que ocorrem na OA são a depleção de proteoglicanos associada à ruptura da rede de colágeno^32,33,34…

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium