İnsan Eklem Kıkırdak Eksplantlarında Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı Mikro Girintide Pratik Konuların Ele Alınması

Summary

Atomik kuvvet mikroskobu mikro girintileriyle ilgili en yaygın sorunları belirlemek ve ele almak için adım adım bir yaklaşım sunuyoruz. Çeşitli derecelerde osteoartrit kaynaklı dejenerasyon ile karakterize edilen yerli insan eklem kıkırdak eksplantlarında ortaya çıkan sorunları örneklendiriyoruz.

Abstract

Şüphesiz, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) şu anda biyolojik alandaki mikro ve hatta nano ipuçlarını değerlendirmek için en güçlü ve kullanışlı tekniklerden biridir. Bununla birlikte, diğer mikroskobik yaklaşımlarda olduğu gibi, metodolojik zorluklar ortaya çıkabilir. Özellikle, numunenin özellikleri, numune hazırlama, alet tipi ve girinti probu istenmeyen artefaktlara yol açabilir. Bu protokolde, ortaya çıkan bu sorunları sağlıklı ve osteoartritik eklem kıkırdağı eksplantları üzerinde örneklendiriyoruz. Bu amaçla, ilk olarak, tüm doku eksplantlarının büyük 2D mozaik floresan görüntülemesi yoluyla, farklı dejenerasyon aşamalarına göre ex vivo eklem kıkırdak disklerinin nasıl oluşturulacağını, derecelendirileceğini ve görsel olarak nasıl sınıflandırılacağını adım adım gösteriyoruz. Ex vivo modelin en büyük gücü, erken başlangıçtan ilerlemeye kadar osteoartrit ile ilişkili değişikliklerin araştırılmasına izin veren yaşlı, yerli, insan kıkırdağını içermesidir. Ek olarak, doku hazırlamadaki yaygın tuzakların yanı sıra gerçek AFM prosedürü ve sonraki veri analizi de sunulmaktadır. Numune hazırlama ve işleme, gelişmiş dejenerasyonun neden olduğu topografik numune özellikleri ve numune-uç etkileşimi gibi temel ancak önemli adımların veri toplamayı nasıl etkileyebileceğini gösteriyoruz. Ayrıca AFM’deki en yaygın sorunları incelemeye tabi tutuyoruz ve mümkün olduğunda bunların nasıl üstesinden gelineceğini açıklıyoruz. Bu sınırlamaların bilinmesi, doğru veri toplama, yorumlama ve nihayetinde bulguların geniş bir bilimsel bağlama yerleştirilmesi için son derece önemlidir.

Introduction

Elektronik cihazların ve sistemlerin sürekli küçülen boyutu nedeniyle, mikro ve nano tabanlı teknoloji ve ekipmanların hızlı gelişimi ivme kazanmıştır. Böyle bir cihaz, biyolojik yüzeyleri tarayabilen ve hem nano hem de mikrometre ölçeklerinde topografik veya biyomekanik bilgileri alabilen^atomik kuvvet mikroskobudur (AFM) ^1,2. Geniş özellikleri arasında, bu araç, çeşitli biyolojik sistemlerin mekanik özellikleri hakkında bilgi edinmek için bir mikro ve bir nano girinti olarak çalıştırılabilir 3,4,5,6. Veriler, ucunda yaklaşık 1 nm kadar küçük olabilen mekanik bir prob aracılığıyla yüzeyle fiziksel temas yoluyla toplanır⁷. Numunenin ortaya çıkan deformasyonu daha sonra konsol ucunun girinti derinliğine ve numuneye uygulanan kuvvete^{göre görüntülenir 8}.

Osteoartrit (OA), eklemlerde ve çevre dokularda eklem kıkırdağının bozulması ile karakterize, kemik yüzeylerinin tamamen açığa çıkmasına yol açabilen uzun süreli dejeneratif kronik bir hastalıktır. AE’nin yükü büyüktür; Şu anda, 65 yaş ve üstü tüm kadınların yarısı ve tüm erkeklerin üçte biri OA^9’dan muzdariptir. Travmalar, obezite ve bunun sonucunda eklemin^{değişmiş biyomekaniği 10}, ortak bir sonuç olarak görülen eklem kıkırdak dejenerasyonunu belirler. Ganz ve arkadaşlarının öncü çalışması, OA sürecinin ilk adımlarının kıkırdak^11’in biyomekanik özelliklerini içerebileceğini öne sürdü ve o zamandan beri araştırmacılar bu hipotezi^{doğruladılar 12}. Benzer şekilde, dokunun biyomekanik özelliklerinin, hücre-hücre ve hücre-matris karışmasının yanı sıra ultrastrüktürel organizasyon tarafından işlevsel olarak düzenlendiği genel olarak kabul edilir. Herhangi bir değişiklik, genel doku biyomekanik işleyişini önemli ölçüde etkileyebilir¹³. Bugüne kadar, OA tanısı kliniktir ve düz film radyografisine dayanmaktadır¹⁴. Bu yaklaşım iki yönlüdür: birincisi, OA tanısını formüle etmek için tanımlanmış bir dejeneratif kesme eşiğinin olmaması, durumun ölçülmesini zorlaştırır ve ikincisi, görüntüleme yöntemleri duyarlılık ve standardizasyondan yoksundur ve lokalize kıkırdak hasarını tespit edemez^15,16,17. Bu amaçla, kıkırdağın mekanik özelliklerinin değerlendirilmesi, hastalığın etiyolojisinden bağımsız olarak OA’nın seyri sırasında değişen ve çok erken bir aşamada doku işlevselliği üzerinde doğrudan etkisi olan bir parametreyi tanımlaması gibi belirleyici bir avantaja sahiptir. Girinti aletleri, dokunun girintiye direnme kuvvetini ölçer. Bu aslında yeni bir kavram değil; En eski çalışmalar 1980’lere ve 1990’lara kadar uzanıyor. Bu dönemde, çok sayıda çalışma, eklem kıkırdağının artroskopik ölçümleri için tasarlanmış indentasyon aletlerinin kıkırdaktaki dejeneratif değişiklikleri saptamak için çok uygun olabileceğini düşündürmektedir. 30 yıl önce bile, bazı çalışmalar, girinti aletlerinin artroskopi sırasında basınç sertliği ölçümleri yaparak doku dejenerasyonu sırasında kıkırdak yüzeyindeki in vivo değişiklikleri tespit edebildiğini gösterebildi^18,19,20.

Eklem kıkırdağının AFM girintisi (AFM-IT), dokunun önemli bir mekanik özelliği, yani sertlik hakkında bilgi sağlar. Bu, uygulanan, tahribatsız bir yük ile girintili doku alanının²¹ ortaya çıkan deformasyonu arasındaki ilişkiyi tanımlayan mekanik bir parametredir. AFM-IT’nin makroskopik olarak etkilenmemiş kollajen ağlarında sertlikteki yaşa bağlı değişiklikleri ölçebildiği, böylece OA başlangıcı ile ilişkili patolojik değişiklikler arasında ayrım yapabildiği gösterilmiştir (eklem kıkırdağında Outerbridge ölçeğinde derece 0)²². Daha önce, AFM-IT’lerin, erken kıkırdak dejenerasyonu için görüntü tabanlı bir biyobelirteç olarak uzamsal kondrosit organizasyonu temelinde, en erken dejeneratif mekanik değişikliklerin yalnızca ölçülmesine değil, aynı zamanda gerçekten belirlenmesine de izin verdiğini göstermiştik. Bu bulgular başkaları tarafından zaten doğrulanmıştır^23,24. Bu nedenle, AFM-IT, erken dejeneratif değişiklikleri teşhis etmek ve tanımlamak için ilginç bir araç görevi görür. Bu değişiklikler zaten hücresel düzeyde ölçülebilir ve OA patofizyolojik sürecinin anlaşılmasını yeniden şekillendirir.

Bu protokolde, doğal kıkırdak eksplantlarının hazırlanmasından AFM veri toplama ve işlemeye kadar eklem kıkırdak eksplantlarının eksiksiz bir histolojik ve biyomekanik derecelendirme prosedürünü gösteriyoruz. Adım adım bir yaklaşımla, eklem kıkırdak dokusunun farklı dejenerasyon aşamalarına göre nasıl oluşturulacağını, derecelendirileceğini ve görsel olarak sınıflandırılacağını, 2D büyük mozaik görüntüleme ve ardından mikro-AFM girintileri ile gösteriyoruz.

Şu anda, AFM-IT, kıkırdaktaki⁷ biyomekanik değişiklikleri ölçmek için en hassas araçlardan biri olmasına rağmen, diğer herhangi bir enstrümantal teknik gibi, hatalı veri toplamaya yol açabilecek sınırlamaları ve pratik özellikleri²⁵ vardır. Bu amaçla, kıkırdak eksplantlarının AFM ölçümleri sırasında ortaya çıkan en yaygın sorunları incelemeye tabi tutuyoruz ve mümkünse bunların nasıl en aza indirileceğini veya üstesinden gelineceğini açıklıyoruz. Bunlar, numunelerin topografik yönlerini ve bunları AFM uyumlu bir ortamda stabilize etmenin zorluklarını, doku yüzeyinin fiziksel özelliklerini ve bu tür yüzeylerde AFM ölçümlerinin gerçekleştirilmesinde ortaya çıkan zorlukları içerir. Hatalı kuvvet-mesafe eğrilerinin örnekleri de sunulmakta ve bunlara neden olabilecek koşullar vurgulanmaktadır. Konsol ucunun geometrisine özgü ek sınırlamalar ve veri analizi için Hertz modelinin kullanımı da tartışılmaktadır.

Protocol

Almanya’da Tübingen Üniversite Hastanesi’nde total diz artroplastisi yapılan hastalardan toplanan femoral kondiller kullanıldı. Bu çalışmaya sadece dejeneratif ve posttravmatik eklem patolojileri olan hastalardan alınan eklem kıkırdak örnekleri dahil edildi. Çalışma başlamadan önce bölüm, kurum ve yerel etik kurul onayı alınmıştır (Proje no.674/2016BO2). Katılım öncesi tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. NOT: Deney adımlarının kronolojik sı…

Representative Results

Kendi kendine yapılan bir kesme cihazı kullanarak, tek bir hücresel uzamsal desen içeren taze insan kondillerinden küçük (4 mm x 1 mm) kıkırdak diskleri çıkarabildik ve üretebildik30 tek sicim (SS, Şekil 2A), çift sicimler (DS), küçük kümeler (SC), büyük kümeler (BC; Şekil 2A) ve dağınık (Şekil 2B). Temsili bir kıkırdak eksplantı Şekil 3A’da gösteri…

Discussion

İlerleyici ve multifaktöriyel bir hastalık olan OA, eklem kıkırdağında yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri tetikler. OA seyri boyunca, mekanik özelliklerdeki bozulmalara eklem kıkırdağı yüzeyindeki yapısal ve biyokimyasal değişiklikler eşlik eder^27,31. OA’da meydana gelen en erken patolojik olaylar, kollajen ağının bozulması ile birlikte proteoglikan tükenmesidir^{32,33,34</s…}

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium