Auseinandersetzung mit praktischen Fragen der Rasterkraftmikroskopie-basierten Mikroeindringung an menschlichen Gelenkknorpelexplantaten

Summary

Wir stellen einen Schritt-für-Schritt-Ansatz vor, um die häufigsten Probleme im Zusammenhang mit Mikroeindrücken in der Rasterkraftmikroskopie zu identifizieren und anzugehen. Wir veranschaulichen die aufkommenden Probleme an nativen menschlichen Gelenkknorpelexplantaten, die durch verschiedene Grade der Arthrose-bedingten Degeneration gekennzeichnet sind.

Abstract

Ohne Zweifel ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) derzeit eine der leistungsfähigsten und nützlichsten Techniken zur Beurteilung von Mikro- und sogar Nanosignalen im biologischen Bereich. Wie bei jedem anderen mikroskopischen Ansatz können jedoch methodische Herausforderungen auftreten. Insbesondere die Eigenschaften der Probe, der Probenvorbereitung, des Gerätetyps und der Eindringsonde können zu unerwünschten Artefakten führen. In diesem Protokoll veranschaulichen wir diese aufkommenden Probleme sowohl an gesunden als auch an osteoarthritischen Gelenkknorpelexplantaten. Zu diesem Zweck zeigen wir zunächst Schritt für Schritt, wie ex vivo Gelenkknorpelscheiben nach verschiedenen Degenerationsstadien mittels großer 2D-Mosaikfluoreszenz-Bildgebung der gesamten Gewebeexplantate erzeugt, klassifiziert und visuell klassifiziert werden können. Die große Stärke des Ex-vivo-Modells besteht darin, dass es aus gealtertem, nativem, menschlichem Knorpel besteht, der es ermöglicht, arthrosebedingte Veränderungen vom frühen Beginn bis zur Progression zu untersuchen. Darüber hinaus werden auch häufige Fallstricke bei der Gewebepräparation sowie das eigentliche AFM-Verfahren zusammen mit der anschließenden Datenanalyse vorgestellt. Wir zeigen, wie sich grundlegende, aber entscheidende Schritte wie die Probenvorbereitung und -verarbeitung, topografische Probeneigenschaften, die durch fortgeschrittene Degeneration verursacht werden, und die Interaktion zwischen Probe und Spitze auf die Datenerfassung auswirken können. Wir nehmen auch die häufigsten Probleme in der AFM unter die Lupe und beschreiben, wo möglich, wie sie überwunden werden können. Die Kenntnis dieser Grenzen ist von größter Bedeutung für die korrekte Datenerfassung, Interpretation und letztlich die Einbettung der Ergebnisse in einen breiten wissenschaftlichen Kontext.

Introduction

Aufgrund der immer kleiner werdenden Größe elektronischer Geräte und Systeme hat die rasante Entwicklung von mikro- und nanobasierten Technologien und Geräten an Dynamik gewonnen. Ein solches Gerät ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM), die biologische Oberflächen scannen und topografische oder biomechanische Informationen sowohl im Nano- als auch im Mikrometerbereich abrufen kann ^1,2. Zu seinen umfangreichen Funktionen gehört, dass dieses Werkzeug sowohl als Mikro- als auch als Nano-Eindringkörper betrieben werden kann, um Informationen über die mechanischen Eigenschaften verschiedener biologischer Systeme zu erhalten 3,4,5,6. Die Daten werden durch physischen Kontakt mit der Oberfläche durch eine mechanische Sonde gesammelt, die an ihrer Spitze⁷ nur etwa 1 nm betragen kann. Die resultierende Verformung der Probe wird dann basierend auf der Eindringtiefe der Cantilever-Spitze und der auf die Probe⁸ ausgeübten Kraft angezeigt.

Arthrose (OA) ist eine langfristige degenerative chronische Erkrankung, die durch eine Verschlechterung des Gelenkknorpels in den Gelenken und dem umliegenden Gewebe gekennzeichnet ist, was zu einer vollständigen Freilegung der Knochenoberflächen führen kann. Die Belastung durch Open Access ist erheblich; derzeit leidet die Hälfte aller Frauen und ein Drittel aller Männer ab 65 Jahren an OA⁹. Traumata, Fettleibigkeit und die daraus resultierende veränderte Biomechanik des Gelenks¹⁰ bestimmen die Degeneration des Gelenkknorpels, die als häufiges Endergebnis angesehen wird. Die bahnbrechende Studie von Ganz et al. postulierte, dass die frühen Schritte des OA-Prozesses die biomechanischen Eigenschaften des Knorpels beinhalten könnten¹¹, und seitdem haben Forscher diese Hypothese bestätigt¹². Ebenso ist es allgemein anerkannt, dass die biomechanischen Eigenschaften des Gewebes funktionell durch die ultrastrukturelle Organisation sowie durch Zell-Zell- und Zell-Matrix-Übersprechen orchestriert werden. Jede Veränderung kann sich dramatisch auf die gesamte biomechanische Funktion des Gewebes auswirken¹³. Bisher ist die Arthrose-Diagnose klinisch und basiert auf der Röntgenaufnahme¹⁴. Dieser Ansatz hat zwei Seiten: Erstens erschwert das Fehlen einer definierten degenerativen Cut-off-Schwelle zur Formulierung der Diagnose Arthrose die Quantifizierung der Erkrankung, und zweitens mangelt es den bildgebenden Verfahren an Sensitivität und Standardisierung und sie können lokalisierte Knorpelschäden nicht erkennen^15,16,17. Dazu hat die Beurteilung der mechanischen Eigenschaften des Knorpels den entscheidenden Vorteil, dass sie einen Parameter beschreibt, der sich im Verlauf der Arthrose unabhängig von der Ätiologie der Erkrankung verändert und bereits in einem sehr frühen Stadium einen direkten Einfluss auf die Gewebefunktionalität hat. Eindringinstrumente messen die Kraft, mit der das Gewebe dem Einzug widersteht. Dies ist in der Tat kein neues Konzept; Die frühesten Studien stammen aus den 1980er und 1990er Jahren. In dieser Zeit deuteten zahlreiche Studien darauf hin, dass Eindringinstrumente, die für die arthroskopischen Messungen von Gelenkknorpel konzipiert sind, gut geeignet sein könnten, degenerative Veränderungen des Knorpels zu erkennen. Bereits vor 30 Jahren konnten einige Studien zeigen, dass Indentationsinstrumente in der Lage sind, in vivo Veränderungen der Knorpeloberfläche während der Gewebedegeneration durch Drucksteifigkeitsmessungen während der Arthroskopie zu erkennen^18,19,20.

Die AFM-Einkerbung (AFM-IT) des Gelenkknorpels gibt Aufschluss über eine zentrale mechanische Eigenschaft des Gewebes, nämlich die Steifigkeit. Hierbei handelt es sich um einen mechanischen Parameter, der den Zusammenhang zwischen einer aufgebrachten, zerstörungsfreien Belastung und der daraus resultierenden Verformung des eingedrückten Gewebebereichs²¹ beschreibt. Es hat sich gezeigt, dass AFM-IT in der Lage ist, altersabhängige Veränderungen der Steifigkeit in makroskopisch nicht beeinflussten Kollagennetzwerken zu quantifizieren und somit zwischen den pathologischen Veränderungen zu unterscheiden, die mit dem Ausbruch von Arthrose verbunden sind (Grad 0 auf der Outerbridge-Skala im Gelenkknorpel)²². Wir haben bereits gezeigt, dass AFM-ITs auf der Grundlage der räumlichen Chondrozytenorganisation als bildbasierter Biomarker für die frühe Knorpeldegeneration es ermöglichen, die frühesten degenerativen mechanischen Veränderungen nicht nur zu quantifizieren, sondern auch tatsächlich zu lokalisieren. Diese Befunde wurden bereits von anderen bestätigt^23,24. Daher ist AFM-IT ein interessantes Werkzeug, um frühe degenerative Veränderungen zu diagnostizieren und zu identifizieren. Diese Veränderungen können bereits auf zellulärer Ebene gemessen werden, was das Verständnis des pathophysiologischen Prozesses der Arthrose verändert.

In diesem Protokoll demonstrieren wir ein vollständiges histologisches und biomechanisches Grading-Verfahren von Gelenkknorpel-Explantaten, von der nativen Knorpel-Explantat-Präparation bis hin zur AFM-Datenerfassung und -verarbeitung. Anhand eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes zeigen wir, wie Gelenkknorpelgewebe nach verschiedenen Stadien der Degeneration mit Hilfe von 2D-Bildgebung mit großem Mosaik, gefolgt von Mikro-AFM-Eindrücken, generiert, klassifiziert und visuell klassifiziert werden kann.

Auch wenn die AFM-IT derzeit eines der empfindlichsten Werkzeuge zur Messung biomechanischer Veränderungen im Knorpel ist⁷, wie jede andere instrumentelle Technik, hat sie Einschränkungen und praktische Besonderheiten²⁵, die zu einer fehlerhaften Datenerfassung führen können. Zu diesem Zweck nehmen wir die häufigsten Probleme, die bei AFM-Messungen der Knorpelexplantate auftreten, unter die Lupe und beschreiben, wo möglich, wie diese minimiert oder überwunden werden können. Dazu gehören topographische Aspekte der Proben und die Schwierigkeiten, sie in einer AFM-kompatiblen Umgebung zu stabilisieren, physikalische Besonderheiten der Gewebeoberfläche und die daraus resultierenden Schwierigkeiten bei der Durchführung von AFM-Messungen auf solchen Oberflächen. Es werden auch Beispiele für fehlerhafte Kraft-Weg-Kurven vorgestellt, wobei die Bedingungen hervorgehoben werden, die sie verursachen können. Weitere Einschränkungen, die sich aus der Geometrie der Kragarmspitze und der Verwendung des Hertz-Modells für die Datenanalyse ergeben, werden ebenfalls diskutiert.

Protocol

Es wurden Femurkondylen von Patienten verwendet, die sich am Universitätsklinikum Tübingen einer Knietotalendoprothetik unterzogen. In diese Studie wurden nur Gelenkknorpelproben von Patienten mit degenerativen und posttraumatischen Gelenkerkrankungen eingeschlossen. Vor Beginn der Studie wurde die Zustimmung der Abteilungs-, institutionellen und lokalen Ethikkommission eingeholt (Projekt Nr. 674/2016BO2). Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. <p class="j…

Representative Results

Mit Hilfe eines selbstgebauten Schneidegeräts konnten wir kleine (4 mm x 1 mm) Knorpelscheiben aus frischen menschlichen Kondylen explantieren und erzeugen, die ein einzelnes zelluläres Raummuster30 aus einzelnen Strängen (SS, Abbildung 2A), Doppelsträngen (DS), kleinen Clustern (SC), großen Clustern (BC; Abbildung 2A) und diffus (Abbildung 2B). Ein repräsentatives Knorpelexplantat ist in <strong class=…

Discussion

Als fortschreitende und multifaktorielle Erkrankung löst Arthrose strukturelle und funktionelle Veränderungen im Gelenkknorpel aus. Im Verlauf der Arthrose gehen Beeinträchtigungen der mechanischen Eigenschaften mit strukturellen und biochemischen Veränderungen an der Oberfläche des Gelenkknorpels einher^27,31. Die frühesten pathologischen Ereignisse, die bei OA auftreten, sind die Erschöpfung von Proteoglykanen in Verbindung mit einer Störung des Kollagen…

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1397-89-3
Atomic force microscop (AFM) head	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	JPK00518
Biocompatible sample glue	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	H000033
Calcein AM	Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA	14948	Cell membrane permeable stain, used for cartilage disc sorting- top view imaging
Cantilever	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SAA-SPH-5UM	Frequency Nom: 30KHz, k: 0.2N/m, lenght nom: 115μm, width nom: 40μm,  geometry: rectangular, cylindrical tip with a 5μm end radius
Cartilage ctting device	Self-made	n/a	Cutting plastic device containing predefined wholes of 4mmx1mm
CDD camera integrated in the AFM	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany	DFK 31BF03
CDD camera integrated in the fluorescence microscope	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	CM3050S
Data Processing Software for the AFM	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Version 5.0.86,  can be downloaded for free from the following website https://customers.jpk.com
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Fluorescence Microscope (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	11889113
Glass block cantiliver holder	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	SP-90-05	Extra long glass block with angled faces, designed especially for the use with the JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
Inverted phase contrast microscope (integrated in the AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F1315
Microscope glass slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	CLS294775X50
Mounting medium With DAPI	ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany	50011	Mounting media with nuclear DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) counterstaining used for cartilage discs  side view imaging
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	P4333
Petri dish heater associated with AFM (Petri Dish Heater)	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather Medical Products, Osaka, Japan	2023-01
Silicone Skirt	Bruker Nano GmbH, Berlin, Germany	n/a	Protective silicone membrane (D55x0.25) which is placed on the basis of the base of the glas block to prevent  medium condensation in the AFM head.
Statistical program – SPSS	IBM, Armonk, New York, USA	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012	Water-soluble embedding medium