خلايا الكبد المحملة بالدهون متأصلة في تجديد الكبد ولكنها عادة ما تضيع عند الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هنا ، نقدم بروتوكول عزل الخلايا الأمثل الذي يحتفظ بخلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه مجموعات تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران.
تم استخدام استئصال الكبد الجزئي على نطاق واسع للتحقيق في تجديد الكبد في الفئران ، ولكن عزل الغلة العالية لخلايا الكبد القابلة للحياة لتطبيقات الخلية المفردة في المصب يمثل تحديا. لوحظ تراكم ملحوظ للدهون داخل خلايا الكبد المتجددة خلال أول 2 أيام من تجديد الكبد الطبيعي في الفئران. هذا ما يسمى بالتنكس الدهني المرتبط بالتجديد العابر (TRAS) مؤقت ولكنه يتداخل جزئيا مع المرحلة التكاثرية الرئيسية. تنقية تدرج الكثافة هي العمود الفقري لمعظم البروتوكولات الحالية لعزل خلايا الكبد الأولية. نظرا لأن التنقية المتدرجة تعتمد على كثافة الخلايا وحجمها ، فإنها تفصل بين مجموعات خلايا الكبد غير الدهنية والخلايا الكبدية الدهنية. لذلك ، غالبا ما تفقد خلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه أجزاء غير تمثيلية من خلايا الكبد.
يصف البروتوكول المقدم طريقة سهلة وموثوقة للعزل في الجسم الحي لتجديد خلايا الكبد بغض النظر عن محتواها من الدهون. يتم عزل خلايا الكبد من ذكور الفئران C57BL / 6 بعد 24-48 ساعة من استئصال الكبد من خلال نهج نضح كولاجيناز كلاسيكي من خطوتين. تدفع المضخة التمعجية القياسية المحاليل الدافئة عبر الوريد الأجوف السفلي القسطرة إلى البقايا ، باستخدام تقنية التروية الرجعية مع التدفق الخارجي عبر الوريد البابي. يتم فصل خلايا الكبد عن طريق كولاجيناز لإطلاقه من كبسولة جليسون. بعد الغسيل والطرد المركزي الدقيق ، يمكن استخدام خلايا الكبد لأي تحليلات المصب. في الختام ، تصف هذه الورقة تقنية مباشرة وقابلة للتكرار لعزل مجموعة تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران. قد تساعد هذه الطريقة أيضا في دراسة مرض الكبد الدهني.
يمكن للكبد تجديد نفسه حتى بعد فقدان الأنسجة بشكل كبير. تتضح هذه القدرة التجديدية الفريدة بوضوح من خلال النموذج التجريبي لاستئصال الكبد الجزئي (70٪) ، والذي تم وصفه لأول مرة في الفئران من قبل هيغينز وأندرسون في عام 19311. في هذا النموذج ، تتم إزالة 70٪ من الكبد جراحيا من الحيوانات عن طريق قص فصوص الكبد الكبيرة. ثم تنمو الفصوص المتبقية من خلال تضخم تعويضي لاستعادة كتلة الكبد الأصلية في غضون أسبوع واحد تقريبا بعد الجراحة ، وإن كان ذلك دون استعادة بنية الكبد الأصلية 2,3. تم تطوير عمليات استئصال الكبد الإضافية بكميات متفاوتة من إزالة الأنسجة ، مثل استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ حيث تكون بقايا الكبد صغيرة جدا بحيث لا يمكن استعادتها ، مما يؤدي في النهاية إلى فشل الكبد بعد استئصال الكبد (PHLF) والموت اللاحق في 30٪ -50٪ من الحيوانات4،5،6. تمكن هذه النماذج من دراسة تجديد الكبد الطبيعي والفاشل ، اعتمادا على كمية الأنسجة المقطوعة (الشكل 1).
على الرغم من أن نماذج الفئران من استئصال الكبد قد استخدمت بنجاح لسنوات عديدة ، إلا أن الأساليب التحليلية الأكثر تقدما لم تسمح إلا مؤخرا برؤية أعمق على مستوى الخلية الواحدة. بالنسبة لمعظم هذه الطرق ، ومع ذلك ، فإن وجود خلايا الكبد الفردية هو شرط أساسي أساسي. تعتمد معظم بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية على تقنية نضح كولاجيناز من خطوتين وتنقية تدرج الكثافة اللاحقة لفصل خلايا الكبد القابلة للحياة عن الحطام وغير المتني ، وكذلك الخلايا الميتة7،8،9. تم وصف هذه الطريقة لأول مرة من قبل بيري وفريند في 196910 وتم تكييفها من قبل Seglen وزملائه في 197211,12. ومع ذلك ، نظرا لأن الطرد المركزي المتدرج يعتمد على كثافة الخلايا وحجمها ، فغالبا ما تفقد خلايا الكبد المحملة بالدهون أثناء التنقية القياسية. في حين أن هذه الخسارة قد تكون ضئيلة بالنسبة للعديد من الأسئلة البحثية ، إلا أنها جانب حاسم لتجديد الكبد المبكر. خلال أول 2 أيام ، تتراكم خلايا الكبد داخل كبد الفأر المتجدد الدهون ، وبالتالي تنمو في الحجم وتغمس في الكثافة. يعمل هذا التنكس الدهني العابر المرتبط بالتجديد (TRAS) على توفير وقود متجدد وهو مؤقت ، ولكنه يتداخل جزئيا مع المرحلة التكاثرية الرئيسية ويتم توزيعه بشكل غير متساو داخل فصيصات الكبد – الوحدات الوظيفية للكبد13,14. بعد استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ ، يحدث TRAS أيضا ولكنه يستمر ، لأن التجدد متوقف ولا تتأكسد الدهون14. لذلك ، فإن التنقية المتدرجة لخلايا الكبد بعد استئصال الكبد بنسبة 70٪ أو 86٪ ستنتج كسور غير تمثيلية ، حيث يتم فقدان معظم خلايا الكبد المحملة بالدهون بسبب كثافتها المنخفضة15.
في بروتوكول العزل المعدل هذا ، يتم عزل خلايا الكبد من الفئران C57BL / 6 بعد 24-48 ساعة من استئصال الكبد من خلال نهج نضح كولاجيناز كلاسيكي من خطوتين. عادة ، يتم القنية والتروية من بقايا عزل الخلايا عن طريق الوريد البابي. ومع ذلك ، فإن المقاومة الوعائية البورتية في البقايا الصغيرة المتبقية بعد الاستئصال الكبير عالية16 ، وبالتالي فإن التروية حساسة. نظرا لأن الوريد الأجوف لا يتأثر باستئصال الكبد ، يمكن إجراء التروية بسهولة في الاتجاه الرجعي عن طريق قنية الوريد الأجوف. تدفع المضخة التمعجية القياسية المحاليل الدافئة عبر الوريد الأجوف السفلي القسطرة إلى بقايا الكبد ، باستخدام التروية الرجعية مع التدفق عبر الوريد البابي (الشكل التكميلي S1). يتم فصل خلايا الكبد عن طريق الكولاجين ويتم إطلاقها من كبسولة جليسون. بعد الغسيل والمعالجة الدقيقة لخلايا الكبد القابلة للحياة عن طريق العزل التدريجي باستخدام نهج الطرد المركزي منخفض السرعة ، يمكن استخدام خلايا الكبد لأي تحليلات المصب.
يوفر البروتوكول المنشور طريقة موثوقة ومباشرة لعزل غلة عالية من خلايا الكبد الفأر الطبيعية والدهنية لتحليلات المصب أحادية الخلية أو التحليل المجمع للخلايا بعد فرز FACS. الميزة المميزة لتنقية تدرج الكثافة هي أن محتوى الدهون الخلوية ليس له أي تأثير أساسي على العائد الفعال لخلايا الكبد. وبالت…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة من قبل Swiss National Fond (منحة المشروع 310030_189262).
Reagents | |||
Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
Materials | |||
25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
Equipment | |||
BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
Isofluran station | Provet | – | – |
Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |