عزل خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران
Summary
خلايا الكبد المحملة بالدهون متأصلة في تجديد الكبد ولكنها عادة ما تضيع عند الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هنا ، نقدم بروتوكول عزل الخلايا الأمثل الذي يحتفظ بخلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه مجموعات تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران.
Abstract
تم استخدام استئصال الكبد الجزئي على نطاق واسع للتحقيق في تجديد الكبد في الفئران ، ولكن عزل الغلة العالية لخلايا الكبد القابلة للحياة لتطبيقات الخلية المفردة في المصب يمثل تحديا. لوحظ تراكم ملحوظ للدهون داخل خلايا الكبد المتجددة خلال أول 2 أيام من تجديد الكبد الطبيعي في الفئران. هذا ما يسمى بالتنكس الدهني المرتبط بالتجديد العابر (TRAS) مؤقت ولكنه يتداخل جزئيا مع المرحلة التكاثرية الرئيسية. تنقية تدرج الكثافة هي العمود الفقري لمعظم البروتوكولات الحالية لعزل خلايا الكبد الأولية. نظرا لأن التنقية المتدرجة تعتمد على كثافة الخلايا وحجمها ، فإنها تفصل بين مجموعات خلايا الكبد غير الدهنية والخلايا الكبدية الدهنية. لذلك ، غالبا ما تفقد خلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه أجزاء غير تمثيلية من خلايا الكبد.
يصف البروتوكول المقدم طريقة سهلة وموثوقة للعزل في الجسم الحي لتجديد خلايا الكبد بغض النظر عن محتواها من الدهون. يتم عزل خلايا الكبد من ذكور الفئران C57BL / 6 بعد 24-48 ساعة من استئصال الكبد من خلال نهج نضح كولاجيناز كلاسيكي من خطوتين. تدفع المضخة التمعجية القياسية المحاليل الدافئة عبر الوريد الأجوف السفلي القسطرة إلى البقايا ، باستخدام تقنية التروية الرجعية مع التدفق الخارجي عبر الوريد البابي. يتم فصل خلايا الكبد عن طريق كولاجيناز لإطلاقه من كبسولة جليسون. بعد الغسيل والطرد المركزي الدقيق ، يمكن استخدام خلايا الكبد لأي تحليلات المصب. في الختام ، تصف هذه الورقة تقنية مباشرة وقابلة للتكرار لعزل مجموعة تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران. قد تساعد هذه الطريقة أيضا في دراسة مرض الكبد الدهني.
Introduction
يمكن للكبد تجديد نفسه حتى بعد فقدان الأنسجة بشكل كبير. تتضح هذه القدرة التجديدية الفريدة بوضوح من خلال النموذج التجريبي لاستئصال الكبد الجزئي (70٪) ، والذي تم وصفه لأول مرة في الفئران من قبل هيغينز وأندرسون في عام 19311. في هذا النموذج ، تتم إزالة 70٪ من الكبد جراحيا من الحيوانات عن طريق قص فصوص الكبد الكبيرة. ثم تنمو الفصوص المتبقية من خلال تضخم تعويضي لاستعادة كتلة الكبد الأصلية في غضون أسبوع واحد تقريبا بعد الجراحة ، وإن كان ذلك دون استعادة بنية الكبد الأصلية 2,3. تم تطوير عمليات استئصال الكبد الإضافية بكميات متفاوتة من إزالة الأنسجة ، مثل استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ حيث تكون بقايا الكبد صغيرة جدا بحيث لا يمكن استعادتها ، مما يؤدي في النهاية إلى فشل الكبد بعد استئصال الكبد (PHLF) والموت اللاحق في 30٪ -50٪ من الحيوانات4،5،6. تمكن هذه النماذج من دراسة تجديد الكبد الطبيعي والفاشل ، اعتمادا على كمية الأنسجة المقطوعة (الشكل 1).
على الرغم من أن نماذج الفئران من استئصال الكبد قد استخدمت بنجاح لسنوات عديدة ، إلا أن الأساليب التحليلية الأكثر تقدما لم تسمح إلا مؤخرا برؤية أعمق على مستوى الخلية الواحدة. بالنسبة لمعظم هذه الطرق ، ومع ذلك ، فإن وجود خلايا الكبد الفردية هو شرط أساسي أساسي. تعتمد معظم بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية على تقنية نضح كولاجيناز من خطوتين وتنقية تدرج الكثافة اللاحقة لفصل خلايا الكبد القابلة للحياة عن الحطام وغير المتني ، وكذلك الخلايا الميتة7،8،9. تم وصف هذه الطريقة لأول مرة من قبل بيري وفريند في 196910 وتم تكييفها من قبل Seglen وزملائه في 197211,12. ومع ذلك ، نظرا لأن الطرد المركزي المتدرج يعتمد على كثافة الخلايا وحجمها ، فغالبا ما تفقد خلايا الكبد المحملة بالدهون أثناء التنقية القياسية. في حين أن هذه الخسارة قد تكون ضئيلة بالنسبة للعديد من الأسئلة البحثية ، إلا أنها جانب حاسم لتجديد الكبد المبكر. خلال أول 2 أيام ، تتراكم خلايا الكبد داخل كبد الفأر المتجدد الدهون ، وبالتالي تنمو في الحجم وتغمس في الكثافة. يعمل هذا التنكس الدهني العابر المرتبط بالتجديد (TRAS) على توفير وقود متجدد وهو مؤقت ، ولكنه يتداخل جزئيا مع المرحلة التكاثرية الرئيسية ويتم توزيعه بشكل غير متساو داخل فصيصات الكبد – الوحدات الوظيفية للكبد13,14. بعد استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ ، يحدث TRAS أيضا ولكنه يستمر ، لأن التجدد متوقف ولا تتأكسد الدهون14. لذلك ، فإن التنقية المتدرجة لخلايا الكبد بعد استئصال الكبد بنسبة 70٪ أو 86٪ ستنتج كسور غير تمثيلية ، حيث يتم فقدان معظم خلايا الكبد المحملة بالدهون بسبب كثافتها المنخفضة15.
في بروتوكول العزل المعدل هذا ، يتم عزل خلايا الكبد من الفئران C57BL / 6 بعد 24-48 ساعة من استئصال الكبد من خلال نهج نضح كولاجيناز كلاسيكي من خطوتين. عادة ، يتم القنية والتروية من بقايا عزل الخلايا عن طريق الوريد البابي. ومع ذلك ، فإن المقاومة الوعائية البورتية في البقايا الصغيرة المتبقية بعد الاستئصال الكبير عالية16 ، وبالتالي فإن التروية حساسة. نظرا لأن الوريد الأجوف لا يتأثر باستئصال الكبد ، يمكن إجراء التروية بسهولة في الاتجاه الرجعي عن طريق قنية الوريد الأجوف. تدفع المضخة التمعجية القياسية المحاليل الدافئة عبر الوريد الأجوف السفلي القسطرة إلى بقايا الكبد ، باستخدام التروية الرجعية مع التدفق عبر الوريد البابي (الشكل التكميلي S1). يتم فصل خلايا الكبد عن طريق الكولاجين ويتم إطلاقها من كبسولة جليسون. بعد الغسيل والمعالجة الدقيقة لخلايا الكبد القابلة للحياة عن طريق العزل التدريجي باستخدام نهج الطرد المركزي منخفض السرعة ، يمكن استخدام خلايا الكبد لأي تحليلات المصب.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول المنشور طريقة موثوقة ومباشرة لعزل غلة عالية من خلايا الكبد الفأر الطبيعية والدهنية لتحليلات المصب أحادية الخلية أو التحليل المجمع للخلايا بعد فرز FACS. الميزة المميزة لتنقية تدرج الكثافة هي أن محتوى الدهون الخلوية ليس له أي تأثير أساسي على العائد الفعال لخلايا الكبد. وبالت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل Swiss National Fond (منحة المشروع 310030_189262).
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. Partial hepatectomy in mice. Lab Animal. 49, 81-88 (2015).
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. . Liver Pathology. , (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, . Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. Hepatocellular carcinoma and lifestyles. Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
