Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones
Summary
Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.
Abstract
La hepatectomía parcial se ha utilizado ampliamente para investigar la regeneración hepática en ratones, pero el aislamiento de altos rendimientos de hepatocitos viables para aplicaciones de células individuales aguas abajo es un desafío. Se observa una marcada acumulación de lípidos dentro de los hepatocitos regeneradores durante los primeros 2 días de regeneración hepática normal en ratones. Esta llamada esteatosis asociada a la regeneración transitoria (TRAS) es temporal, pero se superpone parcialmente a la fase proliferativa principal. La purificación por gradiente de densidad es la columna vertebral de la mayoría de los protocolos existentes para el aislamiento de hepatocitos primarios. Como la purificación de gradiente depende de la densidad y el tamaño de las células, separa las poblaciones de hepatocitos no esteatósicos de las esteatósicas. Por lo tanto, los hepatocitos grasos a menudo se pierden, produciendo fracciones de hepatocitos no representativas.
El protocolo presentado describe un método fácil y fiable para el aislamiento in vivo de hepatocitos regeneradores independientemente de su contenido lipídico. Los hepatocitos de ratones machos C57BL/6 se aíslan 24-48 h después de la hepatectomía mediante un enfoque clásico de perfusión de colagenasa de dos pasos. Una bomba peristáltica estándar impulsa las soluciones calentadas a través de la vena cava inferior cateterizada hacia el remanente, utilizando una técnica de perfusión retrógrada con flujo de salida a través de la vena porta. Los hepatocitos son disociados por la colagenasa para su liberación de la cápsula de Glisson. Después del lavado y la centrifugación cuidadosa, los hepatocitos se pueden usar para cualquier análisis posterior. En conclusión, este artículo describe una técnica sencilla y reproducible para el aislamiento de una población representativa de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones. El método también puede ayudar al estudio de la enfermedad del hígado graso.
Introduction
El hígado puede regenerarse incluso después de una pérdida importante de tejido. Esta capacidad regenerativa única se ilustra explícitamente en el modelo experimental de hepatectomía parcial (70%), descrito por primera vez en ratas por Higgins y Anderson en 19311. En este modelo, el 70% del hígado se extirpa quirúrgicamente de los animales cortando lóbulos hepáticos más grandes. Los lóbulos restantes crecen a través de la hipertrofia compensatoria para restaurar la masa hepática original dentro de aproximadamente 1 semana después de la cirugía, aunque sin restauración de la arquitectura hepática original 2,3. Se han desarrollado hepatectomías adicionales con cantidades variables de extirpación de tejido, como la hepatectomía extendida al 86% donde el remanente hepático es demasiado pequeño para recuperarse, lo que finalmente conduce a insuficiencia hepática posthepatectomía (PHLF) y posterior muerte en 30% -50% de los animales 4,5,6. Estos modelos permiten estudiar la regeneración hepática normal y fallida, dependiendo de la cantidad de tejido resecado (Figura 1).
Aunque los modelos de hepatectomías en ratones se han utilizado con éxito durante muchos años, solo recientemente los métodos analíticos más avanzados han permitido una visión más profunda a nivel de una sola célula. Para la mayoría de estos métodos, sin embargo, la presencia de hepatocitos individuales es un requisito previo básico. La mayoría de los protocolos para el aislamiento de hepatocitos primarios se basan en una técnica de perfusión de colagenasa de dos pasos y la posterior purificación del gradiente de densidad para separar los hepatocitos viables de los desechos y no parenquimatosos, así como las células muertas 7,8,9. Este método fue descrito por primera vez por Berry y Friend en 196910 y adaptado por Seglen y colegas en 197211,12. Sin embargo, como la centrifugación por gradiente depende de la densidad y el tamaño de las células, los hepatocitos cargados de lípidos a menudo se pierden durante la purificación estándar. Si bien tal pérdida puede ser insignificante para muchas preguntas de investigación, es un aspecto crucial para la regeneración temprana del hígado. Durante los primeros 2 días, los hepatocitos dentro del hígado de ratón regenerador acumulan lípidos, creciendo así en tamaño y disminuyendo en densidad. Esta esteatosis asociada a la regeneración transitoria (TRAS) sirve para proporcionar combustible regenerativo y es temporal, pero se superpone parcialmente a la fase proliferativa principal y se distribuye de manera desigual dentro de los lóbulos hepáticos, las unidades funcionales del hígado13,14. Sin embargo, después de una hepatectomía extendida del 86%, la TRAS también ocurre pero persiste, porque la regeneración está estancada y los lípidos no se oxidan14. Por lo tanto, la purificación por gradiente de los hepatocitos después de hepatectomías al 70% u 86% producirá fracciones no representativas, ya que la mayoría de los hepatocitos cargados de lípidos se pierden debido a su baja densidad15.
En este protocolo de aislamiento modificado, los hepatocitos de ratones C57BL / 6 se aíslan 24-48 h después de la hepatectomía mediante un enfoque clásico de perfusión de colagenasa de dos pasos. Por lo general, la canulación y la perfusión del remanente para el aislamiento celular se realizan a través de la vena porta. Sin embargo, la resistencia portovascular en pequeños restos que quedan después de la resección mayor es alta16, y por lo tanto la perfusión es delicada. Debido a que la vena cava no se ve afectada por las hepatectomías, la perfusión se puede realizar fácilmente en la dirección retrógrada a través de la canulación de la vena cava . Una bomba peristáltica estándar impulsa las soluciones calentadas a través de la vena cava inferior cateterizada hacia el remanente hepático, utilizando perfusión retrógrada con flujo de salida a través de la vena porta (Figura suplementaria S1). Los hepatocitos son disociados por colagenasas y liberados de la cápsula de Glisson. Después del lavado y el procesamiento cuidadoso de hepatocitos viables mediante aislamiento gradual utilizando un enfoque de centrifugación de baja velocidad, los hepatocitos se pueden usar para cualquier análisis posterior.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo publicado proporciona un método fiable y sencillo para aislar un alto rendimiento de hepatocitos murinos normales y esteatósicos para análisis descendentes unicelulares o análisis masivos de células después de la clasificación FACS. La clara ventaja sobre la purificación del gradiente de densidad es que el contenido de lípidos celulares no tiene esencialmente ningún impacto en el rendimiento efectivo de los hepatocitos. Por lo tanto, la fracción de hepatocitos esteatósicos se retendrá e incluir?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Fondo Nacional Suizo (subvención del proyecto 310030_189262).
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
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