マウスにおける肝部分切除後の再生肝細胞の単離
Summary
脂質を含んだ肝細胞は肝臓の再生に固有のものですが、通常は密度勾配遠心分離で失われます。ここでは、脂肪肝細胞を保持する最適化された細胞分離プロトコルを提示し、マウスの部分肝切除後に再生肝細胞の代表的な集団を生み出します。
Abstract
部分肝切除術は、マウスの肝再生を調べるために広く使用されていますが、下流の単一細胞アプリケーションのために生存可能な肝細胞の高収率の単離は困難です。再生肝細胞内の脂質の顕著な蓄積は、マウスの正常な肝臓再生の最初の2日間に観察されます。.このいわゆる一過性再生関連脂肪症(TRAS)は一時的なものですが、主要な増殖期と部分的に重複しています。密度勾配精製は、初代肝細胞を単離するための既存のほとんどのプロトコルのバックボーンです。グラジエント精製は細胞の密度とサイズに依存するため、非脂肪性肝細胞集団と脂肪性肝細胞集団を分離します。したがって、脂肪性肝細胞はしばしば失われ、非代表的な肝細胞画分を生じる。
提示されたプロトコルは、脂質含量に関係なく、再生肝細胞の in vivo 単離のための簡単で信頼性の高い方法を記載しています。雄のC57BL / 6マウスからの肝細胞は、肝切除術の24〜48時間後に、古典的な2段階のコラゲナーゼ灌流アプローチによって単離されます。標準的な蠕動ポンプは、門脈からの流出を伴う逆行性灌流技術を使用して、カテーテル挿入された下大静脈 を介して 温められた溶液を残骸に駆動します。肝細胞は、グリッソンカプセルからの放出のためにコラゲナーゼによって解離されます。洗浄と慎重な遠心分離の後、肝細胞はあらゆる下流の分析に使用できます。結論として、この論文は、マウスの部分肝切除後の再生肝細胞の代表的な集団を単離するための簡単で再現性のある技術について説明しています。この方法は、脂肪肝疾患の研究にも役立つ可能性があります。
Introduction
肝臓は、大きな組織喪失の後でもそれ自体を再生することができます。このユニークな再生能力は、1931年にヒギンズとアンダーソンによってラットで最初に記述された部分的(70%)肝切除術の実験モデルによって明示的に示されています1。このモデルでは、肝臓の70%が、より大きな肝葉を切り取ることによって動物から外科的に除去されます。その後、残りの葉は代償性肥大によって成長し、元の肝臓構造の回復はありませんが、手術後約1週間以内に元の肝塊を回復します2,3。肝臓の残骸が小さすぎて回復できない86%拡張肝切除術など、さまざまな量の組織除去を伴う追加の肝切除術が開発されており、最終的には肝切除後肝不全(PHLF)とその後の動物の30%〜50%で死亡します4,5,6。これらのモデルは、切除された組織の量に応じて、正常な肝再生と失敗した肝再生の研究を可能にします(図1)。
肝切除術のマウスモデルは長年にわたって成功裏に使用されてきましたが、最近になってようやく、より高度な分析方法が可能になり、単一細胞レベルでより深い洞察が可能になりました。しかしながら、これらの方法のほとんどにおいて、個々の肝細胞の存在は基本的な前提条件である。初代肝細胞の単離のためのほとんどのプロトコルは、2段階のコラゲナーゼ灌流技術とそれに続く密度勾配精製に基づいており、生存肝細胞を破片や非実質細胞、および死細胞から分離します7、8、9。この方法は、1969年にBerry and Friendによって最初に記述され10、1972年にSeglenらによって適応されました11,12。ただし、グラジエント遠心分離は細胞の密度とサイズに依存するため、脂質を含んだ肝細胞は標準的な精製中に失われることがよくあります。このような喪失は多くの研究課題にとって無視できるかもしれませんが、それは初期の肝再生にとって重要な側面です。最初の2日間で、再生マウス肝臓内の肝細胞は脂質を蓄積し、それによってサイズが大きくなり、密度が低下します。この一過性再生関連脂肪症(TRAS)は、再生燃料を提供するのに役立ち、一時的ですが、主要な増殖期と部分的に重なり、肝臓の機能単位である肝小葉内に不均一に分布しています13,14。しかし、延長された86%肝切除術の後、再生が停滞し、脂質が酸化されていないため、TRASも発生しますが、持続します14。したがって、70%または86%の肝切除後の肝細胞の勾配精製は、ほとんどの脂質を含む肝細胞が低密度のために失われるため、非代表的な画分を生成します15。
この修正された分離プロトコルでは、C57BL / 6マウスからの肝細胞は、肝切除術の24〜48時間後に、古典的な2段階のコラゲナーゼ灌流アプローチによって分離されます。通常、細胞単離のための残骸のカニュレーションおよび灌流は門脈 を介して 行われる。しかし、大切除後に残った小さな残骸では門脈血管抵抗が高く16、灌流は繊細です。大静脈は肝切除の影響を受けないため、大静脈のカニューレ挿入 を介して 逆行方向に灌流を容易に行うことができます。標準的な蠕動ポンプは、門脈からの流出を伴う逆行性灌流を使用して、カテーテル挿入された下大静脈 を介して 加温された溶液を肝臓の残骸に駆動します(補足図S1)。肝細胞はコラゲナーゼによって解離され、グリソンカプセルから放出されます。低速遠心分離アプローチを使用した段階的単離による生存肝細胞の洗浄と慎重な処理の後、肝細胞はあらゆる下流の分析に使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
公開されたプロトコルは、FACSソーティング後の単一細胞下流分析または細胞のバルク分析のために、正常および脂肪性マウス肝細胞の高収率を単離するための信頼性が高く簡単な方法を提供します。密度勾配精製に対する明確な利点は、細胞脂質含有量が肝細胞の有効収量に本質的に影響を与えないことです。したがって、脂肪性肝細胞の割合は保持され、下流の分析に含まれます。これは…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スイス国立財団(プロジェクト助成金310030_189262)の支援を受けました。
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
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