생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리
Summary
지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.
Abstract
부분 간 절제술은 생쥐의 간 재생을 조사하는 데 널리 사용되어 왔지만 다운스트림 단일 세포 적용을 위한 생존 가능한 간세포의 높은 수율의 분리는 어려운 일입니다. 재생 간세포 내 지질의 현저한 축적은 생쥐에서 정상적인 간 재생의 처음 2 일 동안 관찰됩니다. 이 소위 일시적인 재생 관련 지방증(TRAS)은 일시적이지만 주요 증식 단계와 부분적으로 겹칩니다. 밀도 구배 정제는 원발성 간세포의 분리를 위한 대부분의 기존 프로토콜의 중추입니다. 그래디언트 정제는 세포의 밀도와 크기에 의존하기 때문에 비지방성 간세포 집단과 지방성 간세포 집단을 분리합니다. 따라서 지방 간세포는 종종 손실되어 비대표성 간세포 분획을 생성합니다.
제시된 프로토콜은 지질 함량에 관계없이 재생 간세포의 생체 내 분리를 위한 쉽고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 수컷 C57BL/6 마우스의 간세포는 고전적인 2단계 콜라게나제 관류 접근법에 의해 간 절제술 후 24-48시간 후에 분리됩니다. 표준 연동 펌프는 문맥을 통해 유출되는 역행 관류 기술을 사용하여 카테터가 삽입된 하대정맥을 통해 따뜻해진 용액을 잔여물로 구동합니다. 간세포는 Glisson 캡슐에서 방출하기 위해 콜라게나제에 의해 해리됩니다. 세척 및 신중한 원심분리 후, 간세포는 모든 다운스트림 분석에 사용될 수 있습니다. 결론적으로, 이 논문은 생쥐에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 분리하기 위한 간단하고 재현 가능한 기술을 설명합니다. 이 방법은 또한 지방간 질환의 연구에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
간은 주요 조직 손실 후에도 스스로 재생될 수 있습니다. 이 독특한 재생 능력은 1931년 Higgins와 Anderson이 쥐에서 처음 기술한 부분적(70%) 간 절제술의 실험 모델에 의해 명시적으로 설명됩니다1. 이 모델에서는 더 큰 간엽을 잘라내어 동물에서 간장의 70%를 외과적으로 제거합니다. 나머지 엽은 보상 비대를 통해 성장하여 수술 후 약 1 주일 이내에 원래의 간 덩어리를 회복하지만 원래의 간 구조를 복원하지는 않습니다 2,3. 간 잔여물이 너무 작아서 회복할 수 없는 86% 확장 간절제술과 같이 다양한 양의 조직 제거를 가진 추가 간 절제술이 개발되어 결국 간 절제술 후 간부전(PHLF) 및 동물의 30%-50%에서 후속 사망으로 이어집니다 4,5,6. 이 모델은 절제된 조직의 양에 따라 정상 및 실패한 간 재생에 대한 연구를 가능하게 합니다(그림 1).
간 절제술의 마우스 모델은 수년 동안 성공적으로 사용되어 왔지만 최근에야 단일 세포 수준에서 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있는 고급 분석 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법의 대부분에서는 개별 간세포의 존재가 기본 전제 조건입니다. 원발성 간세포의 분리를 위한 대부분의 프로토콜은 2단계 콜라게나제 관류 기술과 사멸 세포뿐만 아니라 파편 및 비실질로부터 생존 가능한 간세포를 분리하기 위한 후속 밀도 구배 정제를 기반으로 합니다 7,8,9. 이 방법은 1969 년 Berry와 Friend에 의해 처음 기술되었으며 1972 년 Seglen과 동료들에 의해 채택되었습니다 11,12. 그러나 그래디언트 원심분리는 세포의 밀도와 크기에 의존하기 때문에 표준 정제 중에 지질이 함유된 간세포가 손실되는 경우가 많습니다. 이러한 손실은 많은 연구 질문에서 무시할 수 있지만 초기 간 재생에 중요한 측면입니다. 처음 2일 동안 재생 중인 마우스 간 내의 간세포는 지질을 축적하여 크기가 커지고 밀도가 떨어집니다. 이 일시적인 재생 관련 지방증 (TRAS)은 재생 연료를 제공하는 역할을하며 일시적이지만 주요 증식 단계와 부분적으로 겹치고 간 소엽 (간 기능 단위13,14) 내에 고르지 않게 분포되어 있습니다. 그러나 연장된 86% 간 절제술 이후에는 TRAS도 발생하지만 재생이 지연되고 지질이 산화되지 않기 때문에 지속된다14. 따라서 70% 또는 86% 간절제술 후 간세포의 기울기 정제는 대부분의 지질이 함유된 간세포가 저밀도로 인해 손실되기 때문에 비대표성 분획을 생성할 수 있다15.
이 수정된 분리 프로토콜에서 C57BL/6 마우스의 간세포는 고전적인 2단계 콜라게나제 관류 접근법에 의해 간 절제술 후 24-48시간 후에 분리됩니다. 일반적으로 세포 분리를 위한 잔류물의 캐뉼라 삽입 및 관류는 문맥을 통해 수행됩니다. 그러나, 대절제 후 남은 작은 잔해에서의 문맥혈관 저항성은 높으며16, 따라서 관류가 미묘하다. 대정맥은 간 절제술의 영향을 받지 않기 때문에 대정맥의 캐뉼라를 통해 역행 방향으로 관류를 쉽게 수행할 수 있습니다. 표준 연동 펌프는 문맥을 통한 유출과 함께 역행성 관류를 사용하여 카테터화된 하대정맥을 통해 따뜻해진 용액을 간 잔여물로 구동합니다(보충 그림 S1). 간세포는 콜라겐 분해 효소에 의해 해리되어 Glisson 캡슐에서 방출됩니다. 저속 원심분리 접근법을 사용하여 단계적 분리에 의해 생존 가능한 간세포를 세척하고 주의 깊게 처리한 후, 간세포는 모든 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
공개된 프로토콜은 FACS 분류 후 단일 세포 다운스트림 분석 또는 세포의 벌크 분석을 위해 정상 및 지방성 쥐 간세포의 높은 수율을 분리하는 신뢰할 수 있고 간단한 방법을 제공합니다. 밀도 구배 정제에 비해 뚜렷한 이점은 세포 지질 함량이 본질적으로 간세포의 효과적인 수율에 영향을 미치지 않는다는 것입니다. 따라서 지방성 간세포의 비율은 유지되고 다운스트림 분석에 포함됩니다. 이것?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 스위스 국립 재단(프로젝트 보조금 310030_189262)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
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