Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen
Summary
Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.
Abstract
Partiële hepatectomie is op grote schaal gebruikt om leverregeneratie bij muizen te onderzoeken, maar de isolatie van hoge opbrengsten van levensvatbare hepatocyten voor downstream eencellige toepassingen is een uitdaging. Een duidelijke accumulatie van lipiden in regenererende hepatocyten wordt waargenomen tijdens de eerste 2 dagen van normale leverregeneratie bij muizen. Deze zogenaamde transient regeneration-associated steatose (TRAS) is tijdelijk maar overlapt gedeeltelijk de belangrijkste proliferatieve fase. Dichtheidsgradiëntzuivering is de ruggengraat van de meeste bestaande protocollen voor de isolatie van primaire hepatocyten. Omdat gradiëntzuivering afhankelijk is van de dichtheid en grootte van cellen, scheidt het niet-steatotische van steatotische hepatocytenpopulaties. Daarom gaan vette hepatocyten vaak verloren, wat niet-representatieve hepatocytenfracties oplevert.
Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare methode voor de in vivo isolatie van regenererende hepatocyten, ongeacht hun lipidegehalte. Hepatocyten van mannelijke C57BL/6-muizen worden 24-48 uur na hepatectomie geïsoleerd door een klassieke tweestaps collagenaseperfusiebenadering. Een standaard peristaltische pomp drijft de verwarmde oplossingen via de gekatheteriseerde inferieure vena cava in het restant, met behulp van een retrograde perfusietechniek met uitstroom door de poortader. Hepatocyten worden gedissocieerd door collagenase voor hun afgifte uit de Glisson-capsule. Na het wassen en zorgvuldig centrifugeren kunnen de hepatocyten worden gebruikt voor eventuele downstream-analyses. Concluderend beschrijft dit artikel een eenvoudige en reproduceerbare techniek voor de isolatie van een representatieve populatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen. De methode kan ook helpen bij de studie van leververvetting.
Introduction
De lever kan zichzelf regenereren, zelfs na groot weefselverlies. Dit unieke regeneratieve vermogen wordt expliciet geïllustreerd door het experimentele model van partiële (70%) hepatectomie, voor het eerst beschreven bij ratten door Higgins en Anderson in 19311. In dit model wordt 70% van de lever operatief verwijderd van dieren door grotere leverkwabben af te knippen. De resterende lobben groeien vervolgens door compenserende hypertrofie om de oorspronkelijke levermassa binnen ongeveer 1 week na de operatie te herstellen, zij het zonder herstel van de oorspronkelijke leverarchitectuur 2,3. Aanvullende hepatectomie met verschillende hoeveelheden weefselverwijdering zijn ontwikkeld, zoals 86% verlengde hepatectomie waarbij het leverrestant te klein is om te herstellen, wat uiteindelijk leidt tot posthepatectomie leverfalen (PHLF) en daaropvolgende dood bij 30% -50% van de dieren 4,5,6. Deze modellen maken de studie van normale en mislukte leverregeneratie mogelijk, afhankelijk van de hoeveelheid gereseceerd weefsel (figuur 1).
Hoewel muismodellen van hepatectomie al vele jaren met succes worden gebruikt, hebben pas onlangs meer geavanceerde analytische methoden een dieper inzicht op eencellig niveau mogelijk gemaakt. Voor de meeste van deze methoden is de aanwezigheid van individuele hepatocyten echter een basisvoorwaarde. De meeste protocollen voor de isolatie van primaire hepatocyten zijn gebaseerd op een tweestaps collagenaseperfusietechniek en daaropvolgende dichtheidsgradiëntzuivering om levensvatbare hepatocyten te scheiden van puin en niet-parenchymaal, evenals dode cellen 7,8,9. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Berry en Friend in 196910 en aangepast door Seglen en collega’s in 197211,12. Omdat gradiëntcentrifugatie echter afhankelijk is van de dichtheid en grootte van cellen, gaan lipide-beladen hepatocyten vaak verloren tijdens standaardzuivering. Hoewel een dergelijk verlies voor veel onderzoeksvragen verwaarloosbaar kan zijn, is het een cruciaal aspect voor vroege leverregeneratie. Tijdens de eerste 2 dagen accumuleren hepatocyten in de regenererende muizenlever lipiden, waardoor ze in omvang toenemen en in dichtheid dalen. Deze voorbijgaande regeneratie-geassocieerde steatose (TRAS) dient om regeneratieve brandstof te leveren en is tijdelijk, maar overlapt gedeeltelijk de belangrijkste proliferatieve fase en is ongelijk verdeeld binnen de leverkwabben – de functionele eenheden van de lever13,14. Na verlengde 86%-hepatectomie treedt TRAS echter ook op, maar blijft bestaan, omdat de regeneratie is vastgelopen en lipiden niet worden geoxideerd14. Daarom zal gradiëntzuivering van hepatocyten na 70% – of 86% -hepatectomie niet-representatieve fracties opleveren, omdat de meeste lipide-beladen hepatocyten verloren gaan vanwege hun lage dichtheid15.
In dit aangepaste isolatieprotocol worden hepatocyten van C57BL/6-muizen 24-48 uur na hepatectomie geïsoleerd door een klassieke tweestaps collagenaseperfusiebenadering. Meestal worden cannulatie en perfusie van het restant voor celisolatie gedaan via de poortader. De portovasculaire weerstand in kleine resten die overblijven na een grote resectie is echter hoog16, en dus is perfusie delicaat. Omdat de vena cava onaangetast blijft door hepatectomie, kan perfusie gemakkelijk in retrograde richting worden uitgevoerd via cannulatie van de vena cava. Een standaard peristaltische pomp drijft de verwarmde oplossingen via de gekatheteriseerde inferieure vena cava in het leverrest, met behulp van retrograde perfusie met uitstroom door de poortader (aanvullende figuur S1). Hepatocyten worden gedissocieerd door collagenasen en vrijgegeven uit de Glisson-capsule. Na het wassen en zorgvuldig verwerken van levensvatbare hepatocyten door stapsgewijze isolatie met behulp van een centrifugatiebenadering met lage snelheid, kunnen de hepatocyten worden gebruikt voor eventuele downstream-analyses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepubliceerde protocol biedt een betrouwbare en eenvoudige methode om een hoge opbrengst van normale en steatotische muizenhepatocyten te isoleren voor eencellige downstream-analyses of bulkanalyse van cellen na FACS-sortering. Het duidelijke voordeel ten opzichte van dichtheidsgradiëntzuivering is dat het cellulaire lipidengehalte in wezen geen invloed heeft op de effectieve opbrengst van hepatocyten. Zo zal de fractie van steatotische hepatocyten worden behouden en opgenomen in downstream-analyses. Dit is niet all…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Swiss National Fond (projectsubsidie 310030_189262).
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. Partial hepatectomy in mice. Lab Animal. 49, 81-88 (2015).
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. . Liver Pathology. , (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, . Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. Hepatocellular carcinoma and lifestyles. Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
