הפטוציטים עמוסי שומנים טבועים בהתחדשות הכבד, אך בדרך כלל הולכים לאיבוד עם צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאים אופטימלי השומר על הפטוציטים סטאטוטיים, ומניב אוכלוסיות מייצגות של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים.
כריתת כבד חלקית נמצאת בשימוש נרחב כדי לחקור התחדשות כבד בעכברים, אך הבידוד של יבולים גבוהים של הפטוציטים קיימא עבור יישומים של תאים בודדים במורד הזרם הוא מאתגר. הצטברות ניכרת של שומנים בתוך hepatocytes התחדשות נצפתה במהלך 2 הימים הראשונים של התחדשות כבד נורמלי בעכברים. סטאטוזיס זה המכונה סטאטוזיס הקשור להתחדשות חולפת (TRAS) הוא זמני אך חופף חלקית לשלב ההתרבות העיקרי. טיהור שיפוע צפיפות הוא עמוד השדרה של רוב הפרוטוקולים הקיימים לבידוד של הפטוציטים ראשוניים. מכיוון שטיהור הדרגתי מסתמך על צפיפות התאים וגודלם, הוא מפריד בין אוכלוסיות הפטוציטים שאינם סטאטוטיים לסטאטוטים. לכן, hepatocytes שומן לעתים קרובות הולכים לאיבוד, מניב שברים hepatocyte לא מייצג.
הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה קלה ואמינה לבידוד in vivo של הפטוציטים מתחדשים ללא קשר לתכולת השומנים שלהם. הפטוציטים מעכברי C57BL/6 זכרים מבודדים 24-48 שעות לאחר כריתת הכבד בגישה קלאסית של זילוח collagenase דו-שלבי. משאבה פריסטלטית סטנדרטית מניעה את התמיסות המחוממות דרך הווריד הנבוב התחתון הצנתורי אל תוך השארית, תוך שימוש בטכניקת זילוח מדרדר עם זרימה החוצה דרך הווריד הפורטלי. הפטוציטים מנותקים על ידי collagenase לשחרורם מהקפסולה של גליסון. לאחר שטיפה וצנטריפוגה זהירה, ניתן להשתמש בהפטוציטים לכל ניתוח במורד הזרם. לסיכום, מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה וניתנת לשחזור לבידוד אוכלוסייה מייצגת של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים. השיטה עשויה גם לסייע בחקר מחלת הכבד השומני.
הכבד יכול לחדש את עצמו גם לאחר אובדן רקמות משמעותי. יכולת התחדשות ייחודית זו מודגמת במפורש על ידי המודל הניסיוני של כריתת כבד חלקית (70%), שתואר לראשונה בחולדות על ידי היגינס ואנדרסון בשנת 19311. במודל זה, 70% מהכבד מוסר בניתוח מבעלי חיים על ידי חיתוך אונות כבד גדולות יותר. האונות הנותרות גדלות באמצעות היפרטרופיה מפצה כדי לשחזר את מסת הכבד המקורית תוך כשבוע לאחר הניתוח, אם כי ללא שחזור של ארכיטקטורת הכבד המקורית 2,3. פותחו כריתות כבד נוספות עם כמויות משתנות של הסרת רקמות, כגון כריתת כבד מורחבת של 86% שבה שארית הכבד קטנה מכדי להתאושש, מה שמוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כבד לאחר כריתת הכבד (PHLF) ומוות לאחר מכן אצל 30%-50% מבעלי החיים 4,5,6. מודלים אלה מאפשרים לחקור התחדשות כבד נורמלית ונכשלת, כתלות בכמות הרקמה שנכרתה (איור 1).
למרות מודלים עכבריים של hepatectomies שימשו בהצלחה במשך שנים רבות, רק לאחרונה שיטות אנליטיות מתקדמות יותר אפשרו תובנה עמוקה יותר ברמת התא הבודד. עבור רוב שיטות אלה, עם זאת, נוכחות של hepatocytes בודדים הוא תנאי מוקדם בסיסי. רוב הפרוטוקולים לבידוד של הפטוציטים ראשוניים מבוססים על טכניקת זילוח קולגנאז דו-שלבית וטיהור שיפוע צפיפות לאחר מכן כדי להפריד הפטוציטים קיימא מפסולת ולא פרנכימליים, כמו גם תאים מתים 7,8,9. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי ברי ופרנד בשנת 196910 ואומצה על ידי סגלן ועמיתיו בשנת 197211,12. עם זאת, מכיוון שצנטריפוגות הדרגתיות מסתמכות על צפיפות התאים וגודלם, הפטוציטים עמוסי השומנים אובדים לעתים קרובות במהלך טיהור סטנדרטי. בעוד אובדן כזה עשוי להיות זניח עבור שאלות מחקר רבות, זהו היבט מכריע עבור התחדשות הכבד מוקדם. במהלך היומיים הראשונים, הפטוציטים בתוך כבד העכבר המתחדש צוברים שומנים, ובכך גדלים בגודל וטובלים בצפיפות. סטאטוזיס חולף זה הקשור להתחדשות (TRAS) משמש לספק דלק רגנרטיבי והוא זמני, אך חופף חלקית לשלב השגשוג העיקרי ומתפלג באופן לא אחיד בתוך אונות הכבד – היחידות התפקודיות של הכבד13,14. עם זאת, לאחר כריתת כבד ממושכת של 86%, TRAS מתרחש גם הוא אך נמשך, מכיוון שההתחדשות נעצרת והשומנים אינם מחומצנים14. לכן, טיהור הדרגתי של הפטוציטים לאחר כריתת כבד של 70% או 86% יניב שברים לא מייצגים, מכיוון שרוב הפטוציטים עמוסי השומנים אובדים בגלל צפיפותם הנמוכה15.
בפרוטוקול בידוד שונה זה, הפטוציטים מעכברי C57BL/6 מבודדים 24-48 שעות לאחר כריתת הכבד על ידי גישה קלאסית של זילוח collagenase בשני שלבים. בדרך כלל, קנולציה וזילוח של השארית לבידוד תאים נעשים דרך וריד הפורטל. עם זאת, ההתנגדות הפורטו-וסקולרית בשרידים קטנים שנותרו לאחר כריתה גדולה היא גבוהה16, ולכן הזלוף עדין. מכיוון שהווריד קאווה אינו מושפע מכריתת הכבד, ניתן לבצע זילוח בקלות בכיוון הנסיגה באמצעות קנולציה של הווריד הנבוב. משאבה פריסטלטית סטנדרטית מניעה את התמיסות המחוממות דרך הווריד הנבוב התחתון הצנתורי אל שארית הכבד, באמצעות זילוח מדרדר עם זרימה דרך הווריד הפורטלי (איור משלים S1). הפטוציטים מנותקים על ידי collagenases ומשוחררים מהקפסולה של Glisson. לאחר שטיפה ועיבוד זהיר של הפטוציטים קיימא על ידי בידוד הדרגתי באמצעות גישת צנטריפוגה במהירות נמוכה, ניתן להשתמש בהפטוציטים לכל ניתוח במורד הזרם.
הפרוטוקול שפורסם מספק שיטה אמינה ופשוטה לבודד תפוקה גבוהה של הפטוציטים מורין רגילים וסטאטוטיים עבור ניתוח חד-תאי במורד הזרם או ניתוח בתפזורת של תאים לאחר מיון FACS. היתרון המובהק על פני טיהור שיפוע צפיפות הוא שלתכולת השומנים התאית אין למעשה השפעה על התפוקה האפקטיבית של הפטוציטים. לפיכך, הח?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית השווייצרית (מענק פרויקט 310030_189262).
Reagents | |||
Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
Materials | |||
25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
Equipment | |||
BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
Isofluran station | Provet | – | – |
Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |