Выделение регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей
Summary
Липидные гепатоциты присущи регенерации печени, но обычно теряются при центрифугировании с градиентом плотности. Здесь мы представляем оптимизированный протокол выделения клеток, который сохраняет стеатотические гепатоциты, давая репрезентативные популяции регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей.
Abstract
Частичная гепатэктомия широко используется для исследования регенерации печени у мышей, но выделение высоких выходов жизнеспособных гепатоцитов для последующих одноклеточных применений является сложной задачей. Заметное накопление липидов в регенерирующих гепатоцитах наблюдается в течение первых 2 дней нормальной регенерации печени у мышей. Этот так называемый преходящий стеатоз, связанный с регенерацией (TRAS), является временным, но частично перекрывает основную пролиферативную фазу. Очистка с градиентом плотности является основой большинства существующих протоколов выделения первичных гепатоцитов. Поскольку градиентная очистка зависит от плотности и размера клеток, она отделяет нестеатотические популяции гепатоцитов от стеатоза. Поэтому жировые гепатоциты часто теряются, образуя нерепрезентативные фракции гепатоцитов.
Представленный протокол описывает простой и надежный метод выделения in vivo регенерирующих гепатоцитов независимо от содержания в них липидов. Гепатоциты самцов мышей C57BL/6 выделяют через 24-48 ч после гепатэктомии классическим двухэтапным подходом к перфузии коллагеназы. Стандартный перистальтический насос нагнетает нагретые растворы через катетеризированную нижнюю полую вену в остаток, используя метод ретроградной перфузии с оттоком через воротную вену. Гепатоциты диссоциируют коллагеназой для их высвобождения из капсулы Глиссона. После промывки и тщательного центрифугирования гепатоциты можно использовать для любых последующих анализов. В заключение, в этой статье описывается простой и воспроизводимый метод выделения репрезентативной популяции регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей. Метод также может помочь в изучении жировой болезни печени.
Introduction
Печень может регенерировать себя даже после значительной потери ткани. Эта уникальная регенеративная способность наглядно иллюстрируется экспериментальной моделью частичной (70%) гепатэктомии, впервые описанной на крысах Хиггинсом и Андерсоном в 1931 году1. В этой модели 70% печени удаляется хирургическим путем у животных путем отсечения более крупных долей печени. Затем оставшиеся доли растут за счет компенсаторной гипертрофии, чтобы восстановить первоначальную массу печени в течение примерно 1 недели после операции, хотя и без восстановления исходной архитектуры печени 2,3. Были разработаны дополнительные гепатэктомии с различным количеством удаления тканей, такие как гепатэктомия с удлинением 86%, когда остаток печени слишком мал для восстановления, что в конечном итоге приводит к печеночной недостаточности после гепатэктомии (PHLF) и последующей смерти у 30-50% животных 4,5,6. Эти модели позволяют изучать нормальную и неудачную регенерацию печени в зависимости от количества резецированной ткани (рис. 1).
Хотя мышиные модели гепатэктомии успешно использовались в течение многих лет, только недавно появились более продвинутые аналитические методы, позволяющие глубже понять на уровне отдельных клеток. Однако для большинства из этих методов наличие отдельных гепатоцитов является основной предпосылкой. Большинство протоколов выделения первичных гепатоцитов основаны на двухступенчатой методике перфузии коллагеназы и последующей градиентной очистке плотности для отделения жизнеспособных гепатоцитов от мусора и непаренхиматозных, а также мертвых клеток 7,8,9. Этот метод был впервые описан Берри и Френдом в 1969 году10 и адаптирован Сегленом и его коллегами в 1972 году11,12. Однако, поскольку градиентное центрифугирование зависит от плотности и размера клеток, насыщенные липидами гепатоциты часто теряются во время стандартной очистки. Хотя такая потеря может быть незначительной для многих исследовательских вопросов, она является важным аспектом для ранней регенерации печени. В течение первых 2 дней гепатоциты в регенерирующей печени мыши накапливают липиды, тем самым увеличиваясь в размерах и уменьшаясь в плотности. Этот транзиторный регенеративный стеатоз (TRAS) служит для обеспечения регенеративного топлива и является временным, но частично перекрывает основную пролиферативную фазу и неравномерно распределен в дольках печени – функциональных единицах печени13,14. Однако после расширенной 86%-гепатэктомии TRAS также возникает, но сохраняется, потому что регенерация останавливается, а липиды не окисляются14. Следовательно, градиентная очистка гепатоцитов после 70% или 86%-гепатэктомии даст нерепрезентативные фракции, поскольку большинство липидных гепатоцитов теряется из-за их низкой плотности15.
В этом модифицированном протоколе изоляции гепатоциты мышей C57BL/6 выделяют через 24-48 ч после гепатэктомии классическим двухэтапным подходом к перфузии коллагеназы. Обычно канюляция и перфузия остатка для выделения клеток проводятся через воротную вену. Тем не менее, портоваскулярное сопротивление в небольших остатках, оставшихся после большой резекции, составляет16, и, таким образом, перфузия является деликатной. Поскольку полая вена остается незатронутой гепатэктомией, перфузия может быть легко выполнена в ретроградном направлении путем канюляции полой вены. Стандартный перистальтический насос подает нагретые растворы через катетеризированную нижнюю полую вену в остаток печени, используя ретроградную перфузию с оттоком через воротную вену (дополнительный рисунок S1). Гепатоциты диссоциируют коллагеназами и высвобождаются из капсулы Глиссона. После промывки и тщательной обработки жизнеспособных гепатоцитов путем ступенчатой изоляции с использованием низкоскоростного центрифугирования гепатоциты можно использовать для любых последующих анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Опубликованный протокол обеспечивает надежный и простой метод выделения высокого выхода нормальных и стеатотических мышиных гепатоцитов для одноклеточного последующего анализа или массового анализа клеток после сортировки FACS. Явное преимущество перед очисткой с градиентом плотно?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Швейцарским национальным фондом (грант проекта 310030_189262).
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. Partial hepatectomy in mice. Lab Animal. 49, 81-88 (2015).
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. . Liver Pathology. , (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, . Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. Hepatocellular carcinoma and lifestyles. Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
