Isolering av regenererande hepatocyter efter partiell hepatektomi hos möss
Summary
Lipidbelastade hepatocyter är inneboende för leverregenerering men förloras vanligtvis vid densitetsgradientcentrifugering. Här presenterar vi ett optimerat cellisoleringsprotokoll som behåller steatotiska hepatocyter, vilket ger representativa populationer av regenererande hepatocyter efter partiell hepatektomi hos möss.
Abstract
Partiell hepatektomi har använts i stor utsträckning för att undersöka leverregenerering hos möss, men isoleringen av höga utbyten av livskraftiga hepatocyter för nedströms encellsapplikationer är utmanande. En markant ackumulering av lipider inom regenererande hepatocyter observeras under de första 2 dagarna av normal leverregenerering hos möss. Denna så kallade övergående regenereringsassocierade steatos (TRAS) är tillfällig men överlappar delvis den stora proliferativa fasen. Densitetsgradientrening är ryggraden i de flesta befintliga protokoll för isolering av primära hepatocyter. Eftersom gradientrening är beroende av cellernas densitet och storlek, separerar den icke-steatotiska från steatotiska hepatocytpopulationer. Därför förloras ofta feta hepatocyter, vilket ger icke-representativa hepatocytfraktioner.
Det presenterade protokollet beskriver en enkel och tillförlitlig metod för in vivo-isolering av regenererande hepatocyter oavsett deras lipidinnehåll. Hepatocyter från manliga C57BL / 6-möss isoleras 24-48 timmar efter hepatektomi genom en klassisk tvåstegs kollagenasperfusionsmetod. En standard peristaltisk pump driver de uppvärmda lösningarna via den kateteriserade underlägsna vena cava in i resten, med hjälp av en retrograd perfusionsteknik med utflöde genom portalvenen. Hepatocyter dissocieras av kollagenas för deras frisättning från Glissons kapsel. Efter tvättning och noggrann centrifugering kan hepatocyterna användas för alla nedströmsanalyser. Sammanfattningsvis beskriver detta dokument en enkel och reproducerbar teknik för isolering av en representativ population av regenererande hepatocyter efter partiell hepatektomi hos möss. Metoden kan också hjälpa till att studera fettlever.
Introduction
Levern kan regenerera sig även efter större vävnadsförlust. Denna unika regenerativa kapacitet illustreras uttryckligen av den experimentella modellen för partiell (70%) hepatektomi, som först beskrevs hos råttor av Higgins och Anderson 19311. I denna modell avlägsnas 70% av levern kirurgiskt från djur genom att klippa av större leverlober. De återstående loberna växer sedan genom kompensatorisk hypertrofi för att återställa den ursprungliga levermassan inom cirka 1 vecka efter operationen, om än utan återställande av den ursprungliga leverarkitekturen 2,3. Ytterligare hepatektomier med varierande mängder vävnadsavlägsnande har utvecklats, såsom 86%-förlängd hepatektomi där leverresterna är för små för att återhämta sig, vilket så småningom leder till posthepatektomi leversvikt (PHLF) och efterföljande död hos 30% -50% av djuren 4,5,6. Dessa modeller möjliggör studier av normal och misslyckad leverregenerering, beroende på mängden resekterad vävnad (figur 1).
Även om musmodeller av hepatektomi har använts framgångsrikt i många år, har först nyligen mer avancerade analysmetoder möjliggjort en djupare insikt på encellsnivå. För de flesta av dessa metoder är emellertid närvaron av enskilda hepatocyter en grundläggande förutsättning. De flesta protokoll för isolering av primära hepatocyter är baserade på en tvåstegs kollagenasperfusionsteknik och efterföljande densitetsgradientrening för att separera livskraftiga hepatocyter från skräp och icke-parenkymala, såväl som döda celler 7,8,9. Denna metod beskrevs först av Berry and Friend 196910 och anpassades av Seglen och kollegor 197211,12. Men eftersom gradientcentrifugering är beroende av cellernas densitet och storlek, förloras lipidbelastade hepatocyter ofta under standardrening. Även om sådan förlust kan vara försumbar för många forskningsfrågor, är det en avgörande aspekt för tidig leverregenerering. Under de första 2 dagarna ackumulerar hepatocyter i den regenererande musleveren lipider och växer därmed i storlek och doppar i densitet. Denna övergående regenereringsassocierade steatos (TRAS) tjänar till att ge regenerativt bränsle och är tillfällig, men överlappar delvis den stora proliferativa fasen och är ojämnt fördelad inom leverlobulerna – de funktionella enheterna i levern13,14. Efter förlängd 86%-hepatektomi förekommer emellertid TRAS också men kvarstår, eftersom regenereringen stoppas och lipider oxiderasinte 14. Därför kommer gradientrening av hepatocyter efter 70%- eller 86%-hepatektomier att ge icke-representativa fraktioner, eftersom de flesta lipidbelastade hepatocyter går förlorade på grund av deras låga densitet15.
I detta modifierade isoleringsprotokoll isoleras hepatocyter från C57BL / 6-möss 24-48 timmar efter hepatektomi genom en klassisk tvåstegs kollagenasperfusionsmetod. Vanligtvis görs kanylering och perfusion av resterna för cellisolering via portalvenen. Det portovaskulära motståndet i små rester kvar efter större resektion är dock högt16, och perfusion är därför känslig. Eftersom vena cava förblir opåverkad av hepatektomier, kan perfusion enkelt utföras i retrograd riktning via kanylering av vena cava. En standard peristaltisk pump driver de uppvärmda lösningarna via den kateteriserade underlägsna vena cava in i leverresten, med retrograd perfusion med utflöde genom portalvenen (kompletterande figur S1). Hepatocyter dissocieras av kollagenaser och frigörs från Glissons kapsel. Efter tvättning och noggrann bearbetning av livskraftiga hepatocyter genom stegvis isolering med hjälp av en låghastighetscentrifugeringsmetod kan hepatocyterna användas för alla nedströmsanalyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det publicerade protokollet ger en tillförlitlig och enkel metod för att isolera ett högt utbyte av normala och steatotiska murina hepatocyter för encellsanalyser nedströms eller bulkanalys av celler efter FACS-sortering. Den distinkta fördelen jämfört med densitetsgradientrening är att det cellulära lipidinnehållet i huvudsak inte har någon inverkan på det effektiva utbytet av hepatocyter. Således kommer fraktionen av steatotiska hepatocyter att behållas och inkluderas i nedströmsanalyser. Detta är inte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Swiss National Fond (projektbidrag 310030_189262).
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. Partial hepatectomy in mice. Lab Animal. 49, 81-88 (2015).
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. . Liver Pathology. , (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, . Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. Hepatocellular carcinoma and lifestyles. Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
