تقييم فعالية الأحماض البيروكسي العضوية للقضاء على الأغشية الحيوية للألبان باستخدام نهج يجمع بين الطرق الثابتة والديناميكية
Summary
يصف هذا البروتوكول نهجا يجمع بين الأساليب الثابتة والديناميكية لتقييم فعالية أحماض البيروكسي العضوية للقضاء على الأغشية الحيوية في صناعة الألبان. ويمكن أيضا استخدام هذا النهج لاختبار فعالية التركيبات البيولوجية أو الكيميائية الجديدة لمكافحة الأغشية الحيوية.
Abstract
إن وجود الأغشية الحيوية في صناعة الألبان هو مصدر قلق كبير ، لأنها قد تؤدي إلى إنتاج منتجات ألبان غير آمنة ومعدلة بسبب مقاومتها العالية لمعظم إجراءات التنظيف المكاني (CIP) المستخدمة بشكل متكرر في مصانع المعالجة. لذلك ، من الضروري تطوير استراتيجيات جديدة لمكافحة الأغشية الحيوية لصناعة الألبان. يهدف هذا البروتوكول إلى تقييم فعالية أحماض البيروكسي العضوية (أحماض peracetic و perpropionic و perlactic ومطهر تجاري قائم على حمض البيراسيتيك) للقضاء على الأغشية الحيوية لمنتجات الألبان باستخدام مزيج من الطرق الثابتة والديناميكية. تم اختبار جميع المطهرات على أقوى البكتيريا المنتجة للأغشية الحيوية في غشاء حيوي واحد أو مختلط باستخدام الحد الأدنى من تركيز استئصال الأغشية الحيوية (MBEC) ، وهي طريقة فحص ثابتة عالية الإنتاجية. وقد نجح وقت التلامس البالغ 5 دقائق مع المطهرات بالتركيزات الموصى بها في القضاء على كل من الأغشية الحيوية المفردة والمختلطة. الدراسات جارية حاليا لتأكيد هذه الملاحظات باستخدام مفاعل الأغشية الحيوية التابع لمركز السيطرة على الأمراض (CDC) ، وهي طريقة ديناميكية لتقليد الظروف في الموقع . يتيح هذا النوع من المفاعلات الحيوية استخدام سطح من الفولاذ المقاوم للصدأ ، والذي يشكل معظم المعدات والأسطح الصناعية. يبدو أن النتائج الأولية من المفاعل تؤكد فعالية الأحماض البيروكسي العضوية ضد الأغشية الحيوية. يمكن استخدام النهج المشترك الموصوف في هذه الدراسة لتطوير واختبار تركيبات بيولوجية أو كيميائية جديدة للسيطرة على الأغشية الحيوية والقضاء على الكائنات الحية الدقيقة.
Introduction
صناعة الألبان هي قطاع صناعي رئيسي في جميع أنحاء العالم ، بما في ذلك في كندا ، حيث يوجد أكثر من 10,500 مزرعة ألبان تنتج ما يقرب من 90 مليون هكتار من الحليب كل عام1. على الرغم من متطلبات النظافة الصارمة المفروضة في صناعة الألبان ، بما في ذلك في مصانع المعالجة ، يشكل الحليب وسيلة استزراع كبيرة للكائنات الحية الدقيقة ، وبالتالي ، من المحتمل أن تحتوي منتجات الألبان على كائنات دقيقة ، بما في ذلك التلف أو الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض. هذه مسببات الأمراض يمكن أن تسبب أمراض مختلفة. على سبيل المثال ، يمكن أن تسبب السالمونيلا sp. والليستيريا المستوحدة التهاب المعدة والأمعاء والتهاب السحايا ، على التوالي2. يمكن أن تؤثر الكائنات الحية الدقيقة التالفة على الجودة والخصائص الحسية لمنتجات الألبان عن طريق إنتاج الغازات أو الإنزيمات خارج الخلية أو الأحماض3. يمكن أيضا تغيير مظهر ولون الحليب ، على سبيل المثال بواسطة Pseudomonas spp.4.
يمكن لبعض هذه الكائنات الحية الدقيقة تشكيل الأغشية الحيوية على أسطح مختلفة ، بما في ذلك الفولاذ المقاوم للصدأ. هذه الأغشية الحيوية تمكن من استمرار وتكاثر الكائنات الحية الدقيقة على سطح المعدات ، وبالتالي تلوث منتجات الألبان5. كما أن الأغشية الحيوية إشكالية بسبب قدرتها على إعاقة انتقال الحرارة وتسريع تآكل المعدات ، مما يؤدي إلى استبدال المعدات قبل الأوان ، وبالتالي إلى خسائر اقتصادية6.
تسمح إجراءات التنظيف المكاني (CIP) لصناعة الأغذية بالتحكم في نمو الكائنات الحية الدقيقة. تتضمن هذه الإجراءات الاستخدام المتسلسل لهيدروكسيد الصوديوم وحمض النيتريك وأحيانا المطهرات التي تحتوي على حمض هيبوكلوروس وحمض البيراسيتيك 7,8. على الرغم من أن حمض هيبوكلوروس فعال للغاية ضد الكائنات الحية الدقيقة ، إلا أنه يتفاعل أيضا مع المواد العضوية الطبيعية ، مما يتسبب في تكوين منتجات ثانوية سامة9. حمض البيراسيتيك لا يولد منتجات ثانوية ضارة10 ؛ ومع ذلك ، فإن فعاليتها ضد الأغشية الحيوية في صناعة الأغذية متغيرة للغاية10,11. في الآونة الأخيرة ، تمت دراسة الأحماض البيروكسي الأخرى ، بما في ذلك أحماض البيروبيون والبيرلاكتيك ، لنشاطها المضاد للميكروبات ، ويبدو أنها بديل جيد للتحكم في نمو الميكروبات في الأغشية الحيوية12,13.
لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى تقييم فعالية أحماض البيروكسي العضوية (أحماض peracetic و perpropionic و perlactic ومطهر قائم على حمض البيراسيتيك) للقضاء على الأغشية الحيوية لمنتجات الألبان باستخدام نهج يجمع بين الحد الأدنى من تركيز استئصال الأغشية الحيوية (MBEC) ، وطريقة فحص ثابتة عالية الإنتاجية ، ومفاعل الأغشية الحيوية لمركز السيطرة على الأمراض (CDC) ، وهي طريقة ديناميكية تحاكي في الموقع شروط. يشار إلى اختبار MBEC فيما يلي باسم “ألواح المعايرة الدقيقة للغشاء الحيوي” في البروتوكول. يوضح البروتوكول المقدم هنا والنتائج التمثيلية فعالية أحماض البيروكسي العضوية وتطبيقها المحتمل للتحكم في الأغشية الحيوية الميكروبية في صناعة الألبان.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان اختبار MBEC (فحص الصفائح الدقيقة للغشاء الحيوي) أول طريقة يتم التعرف عليها كاختبار قياسي للقضاء على الأغشية الحيوية بواسطة ASTM17. أظهرت دراستنا وغيرها أن هناك خطوتين حاسمتين عند استخدام هذا الفحص: خطوة الصوتنة (الوقت والطاقة) ووقت العلاج المطهر18. اقترح ستيوارت وب…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل اتحاد البحوث والابتكارات في مجال الصناعة الحيوية في كيبيك (CRIBIQ) (2016-049-C22) ، Agropur ، Groupe Sani Marc ، ومجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) (RDCPJ516460-17). نشكر تيريزا بانيكوني على المراجعة النقدية للمخطوطة.
Materials
| 0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
| 316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
| 316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
| 96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
| Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
| Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
| AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
| Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
| BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
| Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
| CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
| Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
| Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
| EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
| Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
| Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
| Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
| FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C |
| Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
| Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
| Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
| Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
| Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
| Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
| MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
| MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
| Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
| Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
| Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
| Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
| Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
| Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
| Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
| Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
| Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
| Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
| Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
| Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
| Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
| Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
| Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
| Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
| Vortex | Cole Palmer | UZ-04724-00 | |
| Water bath | VWR | 89202-970 | |
| Zen software | Zeiss |
Riferimenti
- Canada’s dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre Available from: https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance (2017)
- Oliver, S. P., Jayarao, B. M., Almeida, R. A. Foodborne pathogens in milk and the dairy farm environment: food safety and public health implications. Foodborne Pathogens and Disease. 2 (2), 115-129 (2005).
- Fondation de technologie laitière du Québec. . Science et technologie du lait. 3rd edn. , (2018).
- Evanowski, R., et al. Short communication: Pseudomonas azotoformans causes gray discoloration in HTST fluid milk. Journal of dairy science. 100, 7906-7909 (2017).
- Bower, C. K., McGuire, J., Daeschel, M. A. The adhesion and detachment of bacteria and spores on food-contact surfaces. Trends in Food Science & Technology. 7 (5), 152-157 (1996).
- Gupta, S., Anand, S. Induction of pitting corrosion on stainless steel (grades 304 and 316) used in dairy industry by biofilms of common sporeformers. International Journal of Dairy Technology. 71 (2), 519-531 (2018).
- Marchand, S., et al. Biofilm formation in milk production and processing environments; Influence on milk quality and safety. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 11 (2), 133-147 (2012).
- Silva, H. O., et al. Efficiency of different disinfectants on Bacillus cereus sensu stricto biofilms on stainless-steel surfaces in contact with milk. Frontiers in Microbiology. 9, 2934 (2018).
- Sedlak, D. L., von Gunten, U. Chemistry. The chlorine dilemma. Science. 331 (6013), 42-43 (2011).
- vander Veen, S., Abee, T. Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid. International Journal of Food Microbiology. 144 (3), 421-431 (2011).
- Saa Ibusquiza, P., Herrera, J. J., Cabo, M. L. Resistance to benzalkonium chloride, peracetic acid and nisin during formation of mature biofilms by Listeria monocytogenes. Food Microbiology. 28 (3), 418-425 (2011).
- Goetz, C., Larouche, J., Velez Aristizabal, M., Niboucha, N., Jean, J. Efficacy of organic peroxyacids for eliminating biofilm preformed by microorganisms isolated from dairy processing plants. Applied and Environmental Microbiology. 88 (4), 0188921 (2022).
- Vimont, A., Fliss, I., Jean, J. Study of the virucidal potential of organic peroxyacids against norovirus on food-contact surfaces. Food and Environmental Virology. 7 (1), 49-57 (2015).
- ASTM E2562-17. Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2562-17.html (2017)
- ASTM E2871-19. Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single Tube Method. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2871-19.html (2019)
- Niboucha, N., et al. Comparative study of different sampling methods of biofilm formed on stainless-steel surfaces in a CDC biofilm reactor. Frontiers in Microbiology. 13, 892181 (2022).
- ASTM E2799-17. Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2799-17.html (2022)
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. Journal of Microbiological Methods. 102, 55-64 (2014).
- Stewart, P. S., Parker, A. E. Measuring antimicrobial efficacy against biofilms: A meta-analysis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (5), 00020 (2019).
- Lindsay, D. K., Fouhy, K., Loh, M., Malakar, P. The CDC biofilm bioreactor is a suitable method to grow biofilms, and test their sanitiser susceptibilities, in the dairy context. International Dairy Journal. 126, 105264 (2022).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology (Reading). 151, 757-762 (2005).
- Williams, D. L., Woodbury, K. L., Haymond, B. S., Parker, A. E., Bloebaum, R. D. A modified CDC biofilm reactor to produce mature biofilms on the surface of peek membranes for an in vivo animal model application. Current Microbiology. 62 (6), 1657-1663 (2011).
- Pieranski, M. K., Rychlowski, M., Grinholc, M. Optimization of Streptococcus agalactiae biofilm culture in a continuous flow system for photoinactivation studies. Pathogens. 10 (9), 1212 (2021).
- Mendez, E., Walker, D. K., Vipham, J., Trinetta, V. The use of a CDC biofilm reactor to grow multi-strain Listeria monocytogenes biofilm. Food Microbiology. 92, 103592 (2020).
- Salgar-Chaparro, S. J., Lepkova, K., Pojtanabuntoeng, T., Darwin, A., Machuca, L. L. Nutrient level determines biofilm characteristics and subsequent impact on microbial corrosion and biocide effectiveness. Applied and Environmental Microbiology. 86 (7), 02885 (2020).
- Goeres, D. M., Simoes, M., Borges, A., Chaves Simoes, L., et al. Design and Fabrication of Biofilm Reactors. Recent Trends in Biofilm Science and Technology. , 71-88 (2020).
- Fjeld, C. S., Schüller, R. B. Biofilm formation during hexadecane degradation and the effects of flow field and shear stresses. Annual Transactions – The Nordic Rheology Society. 21, 341-346 (2013).
- Gilmore, B. F., Hamill, T. M., Jones, D. S., Gorman, S. P. Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 93 (1), 128-140 (2010).
- Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J. Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow. Biotechnology and Bioengineering. 72 (2), 205-218 (2001).
