静的法と動的法を組み合わせたアプローチによる有機ペルオキシ酸の乳バイオフィルム根絶効果評価
Summary
このプロトコルは、酪農産業におけるバイオフィルムを根絶するための有機ペルオキシ酸の有効性を評価するための静的方法と動的方法を組み合わせたアプローチについて説明しています。このアプローチは、バイオフィルムを制御するための新しい生物学的または化学的製剤の有効性を試験するためにも使用され得る。
Abstract
乳製品業界におけるバイオフィルムの存在は、加工工場で頻繁に使用されるほとんどの定置洗浄(CIP)手順に対する耐性が高いため、安全でない変化した乳製品の生産につながる可能性があるため、大きな懸念事項です。したがって、酪農業界向けの新しいバイオフィルム制御戦略を開発することが不可欠です。このプロトコルは、有機ペルオキシ酸の有効性を評価することを目的としています 静的方法と動的方法の組み合わせを使用して、乳製品バイオフィルムを根絶するための有機ペルオキシ酸(過酢酸、過プロピオン酸、および過乳酸および市販の過酢酸ベースの消毒剤)。すべての消毒剤は、静的ハイスループットスクリーニング法である最小バイオフィルム根絶濃度(MBEC)アッセイを使用して、単一または混合バイオフィルムのいずれかで最も強力なバイオフィルム産生細菌でテストされました。推奨濃度の消毒剤との接触時間5分は、単一バイオフィルムと混合バイオフィルムの両方を根絶することに成功しました。現在、米国疾病対策センター(CDC)のバイオフィルムリアクター(in situ 条件を模倣する動的方法)を使用してこれらの観察を確認するための研究が進行中です。このタイプのバイオリアクターは、ほとんどの産業機器および表面を構成するステンレス鋼の表面の使用を可能にする。反応器からの予備的な結果は、バイオフィルムに対する有機ペルオキシ酸の有効性を確認するようです。この研究で説明されている組み合わせたアプローチは、バイオフィルムを制御し、微生物を根絶するための新しい生物学的または化学的製剤を開発およびテストするために使用できます。
Introduction
酪農産業は、毎年約9,000万hLの牛乳を生産する10,500以上の酪農場があるカナダを含む、世界の主要な産業部門です1。加工工場を含む酪農業界で課せられた厳格な衛生要件にもかかわらず、牛乳は微生物にとって優れた培養培地を構成するため、乳製品には腐敗微生物や病原性微生物などの微生物が含まれている可能性があります。これらの病原体はさまざまな病気を引き起こす可能性があります。たとえば、 サルモネラ 菌と リステリア菌は 、それぞれ胃腸炎と髄膜炎を引き起こす可能性があります2。腐敗微生物は、ガス、細胞外酵素、または酸を生成することにより、乳製品の品質と官能特性に影響を与える可能性があります3。牛乳の外観と色も、例えば シュードモナス 属4によって変更される可能性があります。
これらの微生物のいくつかは、ステンレス鋼を含むさまざまな表面にバイオフィルムを形成することができます。このようなバイオフィルムは、機器の表面での微生物の持続と増殖を可能にし、したがって乳製品の汚染を可能にします5。バイオフィルムは、熱伝達を妨げ、機器の腐食を加速させる能力があるためにも問題があり、機器の早期交換につながり、したがって経済的損失につながります6。
定置洗浄(CIP)手順により、食品業界は微生物の増殖を制御できます。これらの手順には、水酸化ナトリウム、硝酸、および場合によっては次亜塩素酸と過酢酸を含む消毒剤の順次使用が含まれます7,8。次亜塩素酸は微生物に対して非常に効果的ですが、天然有機物とも反応し、有毒な副産物の形成を引き起こします9。過酢酸は有害な副産物を生成しません10;ただし、食品業界におけるバイオフィルムに対するその有効性は非常に変動します10,11。最近、ペルプロピオン酸およびペル乳酸を含む他のペルオキシ酸がそれらの抗菌活性について研究されており、それらはバイオフィルムにおける微生物増殖の制御のための優れた代替手段であるように思われる12,13。
そこで本研究では,有機ペルオキシ酸(過酢酸,過プロピオン酸,過乳酸,過乳酸,過酢酸系消毒剤)の乳用バイオフィルム除菌効果を,最小バイオフィルム消去濃度(MBEC)アッセイ,静的ハイスループットスクリーニング法,およびin situ 模倣動的手法である米国疾病対策センター(CDC)バイオフィルムリアクターと組み合わせたアプローチを用いて,乳用バイオフィルムを除菌する有効性を評価することを目的とした。 条件。MBECアッセイは、以下、プロトコルにおいて「バイオフィルムマイクロタイタープレート」と呼ばれる。ここに提示されたプロトコルと代表的な結果は、有機ペルオキシ酸の有効性と、乳製品産業における微生物バイオフィルムを制御するためのそれらの潜在的な用途を示しています。
Protocol
この記事に含まれる作業には、バイオセーフティレベル2のラボが必要であり、ラバル大学の機関バイオセーフティ委員会によって以前に承認されています(プロジェクト番号119689)。 注: 図1 のフローチャートは、バイオフィルムを根絶するための有機ペルオキシ酸の有効性を評価するために使用された静的アプローチと動的アプローチを組み合わせ?…
Representative Results
SEM分析は、バイオフィルムマイクロプレートペグ上に P.アゾトフォルマンス PFl1Aによって生成されたバイオフィルムの存在を示しています(図2A)。3次元的なバイオフィルム構造を観察することができます。 P. azotoformans PFl1Aは、96ウェルマイクロタイタープレートを使用して強力なバイオフィルム生産者(A570 > 1.5)として以前に同定されました<sup class="…
Discussion
MBECアッセイ(バイオフィルムマイクロプレートアッセイ)は、ASTM17によって標準的なバイオフィルム除菌試験として認められた最初の方法でした。私たちの研究と他の人は、このアッセイを使用するときに2つの重要なステップがあることを示しています:超音波処理ステップ(時間と電力)と消毒剤治療時間18。スチュワートとパーカーはまた、微生物種、バイ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、ケベック州産業研究協会(CRIBIQ)(2016-049-C22)、アグロプール、サニマークグループ、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)(RDCPJ516460-17)の支援を受けました。原稿の批判的なレビューをしてくれたテレサ・パニコニに感謝します。
Materials
| 0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
| 316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
| 316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
| 96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
| Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
| Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
| AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
| Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
| BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
| Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
| CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
| Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
| Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
| EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
| Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
| Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
| Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
| FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C |
| Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
| Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
| Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
| Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
| Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
| Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
| MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
| MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
| Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
| Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
| Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
| Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
| Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
| Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
| Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
| Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
| Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
| Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
| Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
| Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
| Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
| Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
| Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
| Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
| Vortex | Cole Palmer | UZ-04724-00 | |
| Water bath | VWR | 89202-970 | |
| Zen software | Zeiss |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Goetz, C., Niboucha, N., Jubinville, E., Jean, J. Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods. J. Vis. Exp. (190), e64619, doi:10.3791/64619 (2022).