הערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים חלביים בגישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות
Summary
פרוטוקול זה מתאר גישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות להערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים בתעשיית החלב. גישה זו עשויה לשמש גם לבדיקת יעילותן של פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לשליטה בביופילמים.
Abstract
נוכחותם של ביופילמים בתעשיית החלב מעוררת דאגה רבה, שכן הם עלולים להוביל לייצור מוצרי חלב לא בטוחים ומשתנים בשל עמידותם הגבוהה לרוב נהלי הניקיון במקום (CIP) המשמשים לעתים קרובות במפעלי עיבוד. לכן, הכרחי לפתח אסטרטגיות חדשות לבקרת ביופילם עבור תעשיית החלב. פרוטוקול זה נועד להעריך את יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות (חומצות פראצטיות, פרפרופיוניות ופרלקטיות וחומר חיטוי מסחרי על בסיס חומצה פראצטית) להשמדת ביופילמים חלביים באמצעות שילוב של שיטות סטטיות ודינמיות. כל חומרי החיטוי נבדקו על החיידקים החזקים ביותר מייצרי ביופילם בביופילם יחיד או מעורב באמצעות בדיקת ריכוז מיגור הביופילם המינימלי (MBEC), שיטת סינון סטטית בעלת תפוקה גבוהה. זמן מגע של 5 דקות עם חומרי החיטוי בריכוזים המומלצים הצליח לחסל הן את הביופילמים הבודדים והן את הביופילמים המעורבים. מחקרים נמשכים כעת כדי לאשר תצפיות אלה באמצעות כור ביופילם של המרכז לבקרת מחלות (CDC), שיטה דינמית לחיקוי תנאים באתרם . סוג זה של ביוריאקטור מאפשר שימוש במשטח נירוסטה, המהווה את רוב הציוד והמשטחים התעשייתיים. נראה כי התוצאות הראשוניות מהכור מאשרות את יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות כנגד ביופילמים. הגישה המשולבת המתוארת במחקר זה עשויה לשמש לפיתוח ובדיקה של פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לשליטה בביופילמים ולחיסול מיקרואורגניזמים.
Introduction
תעשיית החלב היא מגזר תעשייתי מרכזי ברחבי העולם, כולל בקנדה, שם יש יותר מ -10,500 רפתות המייצרות כמעט 90 מיליון hL חלב מדי שנה1. למרות דרישות ההיגיינה המחמירות המוטלות בתעשיית החלב, כולל במפעלי עיבוד, החלב מהווה מדיום תרבית נהדר למיקרואורגניזמים, ולכן מוצרי חלב עשויים להכיל מיקרואורגניזמים, כולל קלקול או מיקרואורגניזמים פתוגניים. פתוגנים אלה יכולים לגרום למחלות שונות; לדוגמה, Salmonella sp. ו Listeria monocytogenes יכול לגרום גסטרואנטריטיס ודלקת קרום המוח, בהתאמה2. מיקרואורגניזמים מקולקלים יכולים להשפיע על האיכות והתכונות האורגנולפטיות, של מוצרי חלב על ידי ייצור גזים, אנזימים חוץ-תאיים או חומצות3. המראה והצבע של החלב עשויים גם להשתנות, למשל על ידי Pseudomonas spp.4.
חלק מהמיקרואורגניזמים האלה יכולים ליצור ביופילמים על משטחים שונים, כולל נירוסטה. ביופילמים כאלה מאפשרים התמדה וכפל של מיקרואורגניזמים על פני השטח של הציוד, ובכך זיהום של מוצרי חלב5. ביופילמים בעייתיים גם בשל יכולתם לעכב מעבר חום ולהאיץ את הקורוזיה של הציוד, מה שמוביל להחלפה מוקדמת של הציוד ובכך להפסדים כלכליים6.
נהלי ניקוי במקום (CIP) מאפשרים לתעשיית המזון לשלוט בצמיחת מיקרואורגניזמים. הליכים אלה כוללים שימוש רציף של נתרן הידרוקסידי, חומצה חנקתית, ולפעמים חומרי חיטוי המכילים חומצה היפוכלורית וחומצה פראצטית 7,8. למרות חומצה hypochlorous יעיל מאוד נגד מיקרואורגניזמים, זה גם מגיב עם חומר אורגני טבעי, גרימת היווצרות של תוצרי לוואי רעילים9. חומצה פראצטית אינה מייצרת תוצרי לוואי מזיקים10; עם זאת, יעילותו נגד ביופילמים בתעשיית המזון משתנה מאוד10,11. לאחרונה, חומצות פרוקסי אחרות, כולל חומצות פרפרופיוניות ופרלקטיות, נחקרו בזכות הפעילות האנטי-מיקרוביאלית שלהן, ונראה שהן חלופה טובה לשליטה בגדילה מיקרוביאלית בביופילמים12,13.
לכן, מחקר זה נועד להעריך את יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות (חומצות פראצטיות, פרפרופיוניות ופרלקטיות וחומר חיטוי מבוסס חומצה פראצטית) לחיסול ביופילמים של מוצרי חלב באמצעות גישה המשלבת את בדיקת ריכוז מיגור הביופילם המינימלי (MBEC), שיטת סינון סטטית בתפוקה גבוהה, וכור ביופילם של המרכז לבקרת מחלות (CDC), שיטה דינמית המחקה באתרה תנאים. בדיקת MBEC מכונה להלן “לוחות מיקרוטיטר ביופילם” בפרוטוקול. הפרוטוקול המוצג כאן והתוצאות המייצגות מדגימים את יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות ואת יישומן הפוטנציאלי לשליטה בביופילמים מיקרוביאליים בתעשיית החלב.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדיקת MBEC (בדיקת מיקרו-צלחות ביופילם) הייתה השיטה הראשונה שהוכרה כבדיקת ביעור ביופילם סטנדרטית על ידי ASTM17. המחקר שלנו ואחרים הראו כי ישנם שני שלבים קריטיים בעת שימוש בבדיקה זו: שלב הסוניקציה (זמן ועוצמה) וזמן הטיפול בחומר חיטוי18. סטיוארט ופרקר הציעו גם פרמטרים אחרי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc ומועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) (RDCPJ516460-17). אנו מודים לתרזה פניקוני על הביקורת על כתב היד.
Materials
| 0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
| 316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
| 316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
| 96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
| Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
| Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
| AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
| Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
| BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
| Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
| CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
| Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
| Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
| EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
| Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
| Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
| Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
| FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C |
| Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
| Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
| Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
| Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
| Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
| Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
| MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
| MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
| Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
| Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
| Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
| Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
| Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
| Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
| Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
| Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
| Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
| Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
| Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
| Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
| Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
| Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
| Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
| Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
| Vortex | Cole Palmer | UZ-04724-00 | |
| Water bath | VWR | 89202-970 | |
| Zen software | Zeiss |
Riferimenti
- Canada’s dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre Available from: https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance (2017)
- Oliver, S. P., Jayarao, B. M., Almeida, R. A. Foodborne pathogens in milk and the dairy farm environment: food safety and public health implications. Foodborne Pathogens and Disease. 2 (2), 115-129 (2005).
- Fondation de technologie laitière du Québec. . Science et technologie du lait. 3rd edn. , (2018).
- Evanowski, R., et al. Short communication: Pseudomonas azotoformans causes gray discoloration in HTST fluid milk. Journal of dairy science. 100, 7906-7909 (2017).
- Bower, C. K., McGuire, J., Daeschel, M. A. The adhesion and detachment of bacteria and spores on food-contact surfaces. Trends in Food Science & Technology. 7 (5), 152-157 (1996).
- Gupta, S., Anand, S. Induction of pitting corrosion on stainless steel (grades 304 and 316) used in dairy industry by biofilms of common sporeformers. International Journal of Dairy Technology. 71 (2), 519-531 (2018).
- Marchand, S., et al. Biofilm formation in milk production and processing environments; Influence on milk quality and safety. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 11 (2), 133-147 (2012).
- Silva, H. O., et al. Efficiency of different disinfectants on Bacillus cereus sensu stricto biofilms on stainless-steel surfaces in contact with milk. Frontiers in Microbiology. 9, 2934 (2018).
- Sedlak, D. L., von Gunten, U. Chemistry. The chlorine dilemma. Science. 331 (6013), 42-43 (2011).
- vander Veen, S., Abee, T. Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid. International Journal of Food Microbiology. 144 (3), 421-431 (2011).
- Saa Ibusquiza, P., Herrera, J. J., Cabo, M. L. Resistance to benzalkonium chloride, peracetic acid and nisin during formation of mature biofilms by Listeria monocytogenes. Food Microbiology. 28 (3), 418-425 (2011).
- Goetz, C., Larouche, J., Velez Aristizabal, M., Niboucha, N., Jean, J. Efficacy of organic peroxyacids for eliminating biofilm preformed by microorganisms isolated from dairy processing plants. Applied and Environmental Microbiology. 88 (4), 0188921 (2022).
- Vimont, A., Fliss, I., Jean, J. Study of the virucidal potential of organic peroxyacids against norovirus on food-contact surfaces. Food and Environmental Virology. 7 (1), 49-57 (2015).
- ASTM E2562-17. Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2562-17.html (2017)
- ASTM E2871-19. Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single Tube Method. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2871-19.html (2019)
- Niboucha, N., et al. Comparative study of different sampling methods of biofilm formed on stainless-steel surfaces in a CDC biofilm reactor. Frontiers in Microbiology. 13, 892181 (2022).
- ASTM E2799-17. Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2799-17.html (2022)
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. Journal of Microbiological Methods. 102, 55-64 (2014).
- Stewart, P. S., Parker, A. E. Measuring antimicrobial efficacy against biofilms: A meta-analysis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (5), 00020 (2019).
- Lindsay, D. K., Fouhy, K., Loh, M., Malakar, P. The CDC biofilm bioreactor is a suitable method to grow biofilms, and test their sanitiser susceptibilities, in the dairy context. International Dairy Journal. 126, 105264 (2022).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology (Reading). 151, 757-762 (2005).
- Williams, D. L., Woodbury, K. L., Haymond, B. S., Parker, A. E., Bloebaum, R. D. A modified CDC biofilm reactor to produce mature biofilms on the surface of peek membranes for an in vivo animal model application. Current Microbiology. 62 (6), 1657-1663 (2011).
- Pieranski, M. K., Rychlowski, M., Grinholc, M. Optimization of Streptococcus agalactiae biofilm culture in a continuous flow system for photoinactivation studies. Pathogens. 10 (9), 1212 (2021).
- Mendez, E., Walker, D. K., Vipham, J., Trinetta, V. The use of a CDC biofilm reactor to grow multi-strain Listeria monocytogenes biofilm. Food Microbiology. 92, 103592 (2020).
- Salgar-Chaparro, S. J., Lepkova, K., Pojtanabuntoeng, T., Darwin, A., Machuca, L. L. Nutrient level determines biofilm characteristics and subsequent impact on microbial corrosion and biocide effectiveness. Applied and Environmental Microbiology. 86 (7), 02885 (2020).
- Goeres, D. M., Simoes, M., Borges, A., Chaves Simoes, L., et al. Design and Fabrication of Biofilm Reactors. Recent Trends in Biofilm Science and Technology. , 71-88 (2020).
- Fjeld, C. S., Schüller, R. B. Biofilm formation during hexadecane degradation and the effects of flow field and shear stresses. Annual Transactions – The Nordic Rheology Society. 21, 341-346 (2013).
- Gilmore, B. F., Hamill, T. M., Jones, D. S., Gorman, S. P. Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 93 (1), 128-140 (2010).
- Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J. Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow. Biotechnology and Bioengineering. 72 (2), 205-218 (2001).
