정적 방법과 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 낙농 생물막을 박멸하기 위한 유기 과산화산의 효능 평가
Summary
이 프로토콜은 낙농 산업에서 생물막을 박멸하기 위한 유기 퍼옥시산의 효능을 평가하기 위해 정적 및 동적 방법을 결합한 접근 방식을 설명합니다. 이 접근법은 또한 생물막을 제어하기 위한 새로운 생물학적 또는 화학적 제형의 효과를 시험하기 위해 사용될 수 있다.
Abstract
낙농 산업에서 생물막의 존재는 가공 공장에서 자주 사용되는 대부분의 CIP(clean-in-place) 절차에 대한 높은 내성으로 인해 안전하지 않고 변경된 유제품의 생산으로 이어질 수 있기 때문에 주요 관심사입니다. 따라서 낙농 산업을 위한 새로운 생물막 제어 전략을 개발하는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜은 정적 및 동적 방법의 조합을 사용하여 유제품 생물막을 박멸하기 위한 유기 과록시산(과초산, 과프로피온산 및 과락트산 및 상업용 과초산 기반 소독제)의 효능을 평가하는 것을 목표로 합니다. 모든 소독제는 정적 고처리량 스크리닝 방법인 최소 생물막 박멸 농도(MBEC) 분석을 사용하여 단일 또는 혼합 생물막에서 가장 강력한 생물막 생성 박테리아에 대해 테스트되었습니다. 권장 농도의 소독제와 5분의 접촉 시간으로 단일 및 혼합 생물막을 모두 성공적으로 박멸했습니다. 현장 조건을 모방하는 동적 방법인 질병 통제 센터(CDC) 생물막 반응기를 사용하여 이러한 관찰을 확인하기 위한 연구가 현재 진행 중입니다. 이러한 유형의 생물 반응기는 대부분의 산업 장비 및 표면을 구성하는 스테인리스 스틸 표면을 사용할 수 있습니다. 반응기의 예비 결과는 생물막에 대한 유기 퍼옥시산의 효능을 확인하는 것으로 보입니다. 이 연구에서 설명된 결합된 접근 방식은 생물막을 제어하고 미생물을 박멸하기 위한 새로운 생물학적 또는 화학적 제형을 개발하고 테스트하는 데 사용될 수 있습니다.
Introduction
낙농 산업은 캐나다를 포함하여 전 세계적으로 주요 산업 부문으로, 10,500개 이상의 낙농장에서 매년 약 9,000만 hL의 우유를 생산하고 있습니다1. 가공 공장을 포함하여 낙농 산업에서 부과되는 엄격한 위생 요구 사항에도 불구하고 우유는 미생물을 위한 훌륭한 배양 배지를 구성하므로 유제품에는 부패 또는 병원성 미생물을 포함한 미생물이 포함될 가능성이 높습니다. 이 병원체는 다양한 질병을 일으킬 수 있습니다. 예를 들어, 살모넬라균 과 리스테리아 모노사이토제네스는 각각 위장염과 수막염을 유발할 수 있다2. 부패 미생물은 가스, 세포외 효소 또는 산을 생성하여 유제품의 품질과 관능적 특성에 영향을 미칠 수 있다3. 우유의 모양과 색상은 예를 들어 Pseudomonas spp.4에 의해 변경될 수도 있습니다.
이러한 미생물 중 일부는 스테인리스 스틸을 포함하여 다양한 표면에 생물막을 형성할 수 있습니다. 이러한 생물막은 장비 표면의 미생물의 지속성 및 증식을 가능하게 하여 유제품의 오염을 가능하게 한다5. 생물막은 또한 열 전달을 방해하고 장비의 부식을 가속화하여 장비의 조기 교체로 이어져 경제적 손실을 초래하기 때문에 문제가 된다6.
CIP(Clean-in-Place) 절차를 통해 식품 산업은 미생물의 성장을 제어할 수 있습니다. 이러한 절차에는 수산화 나트륨, 질산 및 때로는 하이포아염소산 및과 아세트산 7,8을 함유 한 살균제의 순차적 사용이 포함됩니다. 하이포아염소산은 미생물에 대해 매우 효과적이지만 천연 유기물과도 반응하여 독성 부산물을 형성합니다9. 과초산은 유해한 부산물을 생성하지 않는다10; 그러나 식품 산업에서 생물막에 대한 효과는 매우 다양합니다10,11. 최근에, 퍼프로피온산 및 퍼락트산을 포함한 다른 퍼옥시산이 항균 활성에 대해 연구되었으며, 이들은 생물막에서 미생물 성장을 조절하기 위한 좋은 대안으로 보인다12,13.
따라서 본 연구는 최소 생물막 박멸 농도(MBEC) 분석법, 정적 고처리량 스크리닝 방법, 질병통제센터(CDC) 생물막 반응기, in situ를 모방한 동적 방법을 결합한 접근법을 사용하여 유제품 생물막 박멸을 위한 유기 과록시산(과초산, 과프로피온산, 과락트산 및 과초산 기반 소독제)의 효능을 평가하는 것을 목표로 했습니다 여건. MBEC 분석은 이후 프로토콜에서 “생물막 마이크로타이터 플레이트”로 지칭된다. 여기에 제시된 프로토콜과 대표적인 결과는 유기 퍼옥시산의 효능과 낙농 산업에서 미생물 생물막을 제어하기 위한 잠재적 응용을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBEC 분석법(biofilm microplate assay)은 ASTM17에 의해 표준 생물막 박멸 시험법으로 인정된 최초의 방법이었다. 우리의 연구와 다른 사람들은이 분석을 사용할 때 두 가지 중요한 단계가 있음을 보여주었습니다 : 초음파 처리 단계 (시간 및 전력)와 소독제 처리 시간18. Stewart와 Parker는 또한 미생물 종, 생물막 나이, 표면적/부피 비율 등과 같은 분석 결과에 영향을 미칠 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc 및 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) (RDCPJ516460-17)의 지원을 받았습니다. 원고에 대한 비판적 검토에 대해 Teresa Paniconi에게 감사드립니다.
Materials
| 0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
| 316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
| 316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
| 96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
| Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
| Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
| AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
| Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
| BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
| Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
| CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
| Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
| Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
| EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
| Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
| Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
| Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
| FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C |
| Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
| Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
| Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
| Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
| Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
| Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
| MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
| MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
| Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
| Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
| Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
| Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
| Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
| Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
| Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
| Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
| Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
| Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
| Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
| Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
| Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
| Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
| Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
| Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
| Vortex | Cole Palmer | UZ-04724-00 | |
| Water bath | VWR | 89202-970 | |
| Zen software | Zeiss |
Riferimenti
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