Summary
Dit protocol beschrijft de procedure voor genoombewerking in van beenmerg afgeleide macrofagen van muizen met behulp van Cas9-sgRNA ribonucleoproteïnecomplexen die in vitro zijn geassembleerd en door elektroporatie worden afgeleverd.
Abstract
Van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's) van muizen zijn een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van de complexe biologie van weefselmacrofagen. Als primaire cellen modelleren ze de fysiologie van macrofagen in vivo nauwkeuriger dan onsterfelijke macrofaagcellijnen en kunnen ze worden afgeleid van muizen die al gedefinieerde genetische veranderingen dragen. Het verstoren van de genfunctie in BMDM's blijft echter technisch uitdagend. Hier bieden we een protocol voor efficiënte CRISPR/Cas9-genoombewerking in BMDM's, dat de introductie van kleine inserties en deleties (indels) mogelijk maakt die resulteren in frameshift-mutaties die de genfunctie verstoren. Het protocol beschrijft hoe single-guide RNA's (sgRNA-Cas9) kunnen worden gesynthetiseerd en gezuiverde sgRNA-Cas9 ribonucleoproteïnecomplexen (RNP's) kunnen worden gevormd die kunnen worden afgeleverd door elektroporatie. Het biedt ook een efficiënte methode voor het bewaken van de bewerkingsefficiëntie met behulp van routinematige Sanger-sequencing en een gratis beschikbaar online analyseprogramma. Het protocol kan binnen 1 week worden uitgevoerd en vereist geen plasmideconstructie; Het resulteert doorgaans in een bewerkingsefficiëntie van 85% tot 95%.
Introduction
Macrofagen zijn aangeboren immuuncellen die een cruciale rol spelen bij weefselherstel en immuniteit 1,2. Onsterfelijke macrofaagcellijnen, zoals RAW 264.7-cellen van muizen of menselijke THP-1-cellen, hebben verschillende gunstige eigenschappen, waaronder robuuste groei en gemakkelijke genverstoring door vectoren te leveren voor RNA-interferentie of CRISPR/Cas9 3,4. Oncogene transformatie verandert echter hun fysiologie drastisch, wat resulteert in de afwijkende activering van sommige paden en gedempte reacties van andere 5,6. Primaire beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDM's) recapituleren nauwer in vivo macrofaagfysiologie, maar blijven een uitdaging om genetisch te manipuleren vanwege de lage efficiëntie van zowel plasmidetransfectie als virale transductie in deze primaire immuuncellen 7,8. Er zijn dus efficiëntere methoden nodig om de genfunctie te verstoren.
CRISPR/Cas9-genoombewerking is een krachtig hulpmiddel voor genetische manipulatie in een reeks biologische systemen, waaronder zoogdiercellen 9,10,11,12. Het Streptococcus pyogenes Cas9-eiwit splitst efficiënt en specifiek dubbelstrengs DNA wanneer het wordt gecomplexeerd met een sequentiespecifiek gids-RNA. DNA-reparatie door de niet-homologe eindverbinding (NHEJ) van het gespleten DNA resulteert in kleine inserties of deleties (indels) die frameshift-mutaties veroorzaken. In vroege studies werden Cas9 en sgRNA's afgeleverd via plasmide- of lentivirale vectoren, die effectieve toedieningsmethoden zijn voor veel cellijnen 9,10. Primaire cellen en in het bijzonder primaire immuuncellen zijn echter vaak ongevoelig voor deze methoden vanwege de lage efficiëntie van vectorafgifte door transfectie of transductie. Vervolgens zijn methoden ontwikkeld om sgRNA-Cas9-complexen in vitro te genereren en deze via elektroporatie af te leveren, en deze methoden hebben een hoge efficiëntie bereikt in verschillende celtypen13,14. De resultaten suggereren de mogelijkheid om deze aanpak te gebruiken om genoombewerking uit te voeren in primaire macrofagen.
Hier bieden we een protocol voor het gebruik van sgRNA-Cas9 ribonucleoproteïnecomplexen (RNP's) om genoombewerking uit te voeren in primaire BMDM's. Het bevat stappen om de activering van de immuunsensoren die aanwezig zijn in primaire immuuncellen te verminderen en resulteert in tot 95% bewerking op gerichte loci met minimale toxiciteit. Dit protocol omvat ook workflows om de bewerkingsefficiëntie te evalueren met behulp van routinematige polymerasekettingreactie (PCR) en Sanger-sequencing, gevolgd door in silico-analyse door Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, een goed gevalideerde online softwaretool.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA-ontwerp
OPMERKING: Deze stap beschrijft de selectie van de doelsequenties en het ontwerp van de sgRNA's. Het is nuttig om handleidingen te ontwerpen die zich in het eerste grote coderende exon bevinden, zodat elk vertaald eiwit vroeg in het open leesframe wordt verstoord. Het is ook nuttig om doelsequenties te selecteren die binnen hetzelfde exon liggen, omdat dit de analyse van de bewerkingsefficiëntie stroomlijnt (stap 6). De voorbeelden van genoombewerking die bij dit protocol werden geleverd, gebruikten sgRNA's die gericht waren op het eerste exon van het Src-gen en het Cblb-gen , evenals in de niet-coderende Rosa26-locus van het muizengenoom.
- Identificeer 20 nucleotidegenomische sequenties om te targeten, met behulp van een van de verschillende gratis online ontwerptools (tabel 1). Selecteer vier tot vijf gidsen die elkaar niet overlappen binnen elk gen, aangezien de Cas9-activiteit varieert per specifieke gids die wordt gekozen, en een voorspelling a priori van een zeer actieve gids niet mogelijk is.
NOTITIE: Het is van cruciaal belang om te zorgen voor de juiste oriëntatie van de geleider ten opzichte van de volgorde van de beoogde locus. Ontwerptools bieden doorgaans de geleidingssequentie in een oriëntatie van 5' tot 3', ongeacht welke chromosomale streng het doelwit is. Om de oriëntatie van de streng te verifiëren, controleert u of er een protospacer aangrenzende motief (PAM)-sequentie is voor S. pyogenes Cas9 (nGG) onmiddellijk 3' van de beoogde genomische sequentie. De sgRNA-sequentie omvat niet de PAM.
2. sgRNA-synthese
OPMERKING: In deze stap wordt beschreven hoe sgRNA's kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van PCR om een sjabloon voor in-vitrotranscriptie (IVT) te genereren en vervolgens het sgRNA te zuiveren met behulp van spinkolommen (Figuur 1A). Op maat gemaakte synthetische sgRNA's zijn via verschillende leveranciers in de handel verkrijgbaar als alternatief voor PCR/IVT.
- Voer PCR uit om de IVT-sjabloon voor T7 RNA-polymerase te genereren. De PCR-reactie maakt gebruik van universele primers die een T7-RNA-polymerasepromotor en transactiverende CRISPR-RNA (tracrRNA)-sequentie bevatten (tabel 2), naast korte individuele primers met de genspecifieke gidssequentie.
- Dit is de niet-versterkende overlappende uitbreidingsstap. Verdun de PCR-buffer tot 1x en voeg nog eens 1 mM MgCl2 toe. Voeg vervolgens 0,25 μL high-fidelity DNA-polymerase, 0,5 mM deoxynucleotidetrifosfaat (dNTP), 0,02 mM gidsspecifieke primer en 0,02 mM T7 omgekeerde lange universele primer (tabel 2) toe tot een totaal volume van 46 μL. Plaats vervolgens de buis in de thermocycler en voer twee cycli uit van: 95 °C gedurende 15 s, 37 °C gedurende 15 s en 72 °C gedurende 15 s. Koel de reacties op ijs.
- Dit is de PCR-amplificatiestap. Voeg aan elke reactie 2 μL 25 mM voorwaartse versterkingsprimer en 2 μL 25 mM omgekeerde versterkingsprimer toe. Het uiteindelijke reactievolume is 50 μL. Denatureren gedurende 30 s bij 95 °C. Voer vervolgens 35 cycli uit van: 95 °C gedurende 15 s, 65 °C gedurende 20 s en 72 °C gedurende 15 s. Voer een extra verlenging uit bij 72 °C gedurende 2 min.
- Controleer het PCR-reactieproduct op een 2% agarosegel. Overlap-extensie PCR resulteert in een dsDNA-molecuul van 127 bp met de T7-promotor stroomopwaarts van de genspecifieke 20-nucleotidegids en het tracrRNA onmiddellijk stroomafwaarts (Figuur 1B).
- IVT-sjabloonzuivering: Er zijn tal van protocollen en kits die hiervoor goed werken. Dit protocol maakt gebruik van vaste-fase reversibele immobilisatie (SPRI) korrels. Meng 50 μL van het PCR-product met 90 μL parels en volg de instructies van de fabrikant. Eliseer het DNA door 40 μL buffer (5 mM Tris, 0,1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA]) toe te voegen en gedurende 5 minuten te verwarmen bij 65 °C.
- Meet de DNA-concentratie van de IVT-sjabloon met behulp van absorptie bij een golflengte van 260 nm. Voor IVT is een DNA-concentratie van minimaal 50 ng/μL nodig. Het IVT-sjabloon kan worden opgeslagen bij -20 °C.
- IVT-reactie
- Gebruik een in de handel verkrijgbare kit die is ontworpen om hoge opbrengsten van IVT te produceren (zie Materiaaltabel). Volg de aanbevelingen van de fabrikant om de IVT-reactie uit te voeren. Gebruik 250 ng IVT-sjabloon in een reactie van 20 μl en incubeer gedurende 4-16 uur bij 37 °C.
- Controleer het IVT-sgRNA-product door 1 μL van de reactie uit te voeren op een 2% agarosegel. Er moet een heldere RNA-band worden waargenomen, die vergelijkbaar is met 70 bp dsDNA (Figuur 1C). Hoewel het niet verplicht is, gebruikt u een RNA-monsterbuffer met ureum en denatureert u het monster bij 65 °C gedurende 5 minuten voordat u het laadt.
OPMERKING: Vage banden met een hoger molecuulgewicht en kleine migratieverschillen kunnen worden waargenomen bij sommige gids-RNA's als gevolg van verschillen in de secundaire structuur van het RNA.
- Defosforylaat het sgRNA IVT-product om de activering van RIG-I (een vreemde RNA-sensor) en de daaropvolgende celdood na elektroporatie te minimaliseren. Voeg voor elke IVT-reactie van 20 μl 69 μl water van moleculair niveau en 15 E darmfosfatase (CIP) van kalveren toe in 1x CIP-buffer. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
- Verlaag de IVT-sjabloon om de activering van cellulaire DNA-sensoren, die celdood veroorzaken na elektroporatie, te minimaliseren. Voeg aan elke IVT-reactie 2 U RNase-vrij DNase toe. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C. Het IVT-product kan gedurende 1 dag bij -20 °C of enkele maanden bij -80 °C worden bewaard.
- Zuiver het IVT-product met behulp van spinkolommen. Voor deze stap zijn SPRI-kralenzuiveringskits inferieur.
- Bind het RNA aan de kolom door 220 μL bindingsbuffer toe te voegen aan het IVT-product, gevolgd door 1 ml 100% ethanol van moleculair-biologische kwaliteit. Meng goed en laad de kolom. Volg daarna de instructies van de fabrikant. Voer de laatste wasbeurt uit in een bioveiligheidskast met laminaire stroming om besmetting van het sgRNA te voorkomen.
- Voer de elutie uit in de laminaire stromingskap om verontreiniging te voorkomen. Elueer het RNA met behulp van 30 μL steriele 10 mM Tris-buffer (pH 8,0).
- Meet de concentratie van sgRNA door de absorptie te meten bij een golflengte van 260 nm.
OPMERKING: Typische sgRNA-opbrengsten zijn ten minste 100 μg. - Bewaar het sgRNA bij -80 °C. Maak aliquots om meer dan drie vries-dooicycli te voorkomen.
3. Voorbereiding voor elektroporatie
NOTITIE: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap om verontreiniging te voorkomen. Dit protocol maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar elektroporatiesysteem (zie Materiaaltabel) met tips van 10 μL.
- Ontdooi de BMDM's 48-72 uur voor gebruik en breid ze uit op niet met weefselkweek (TC) behandelde platen.
OPMERKING: Per reactie zijn 4 x 105 cellen nodig. - Steriliseer PCR-buisjes voor reactie-assemblage. Maak één PCR-buisje per reactie klaar en verwarm ze gedurende 10 minuten in een thermocycler bij 98 °C. Bereid de buizen in porties voor en bewaar ze gesloten. Plaats de gesteriliseerde PCR-buisjes op ijs wanneer ze klaar zijn voor gebruik.
- Reinig het pipetstation met 70% ethanol en plaats het in de laminaire stromingskap. Stel de parameters in op 1.900 V, 20 ms en één puls.
- Haal een transfectiebuis voorzichtig uit de verpakking om deze steriel te houden en vul deze met 3 ml "E"-buffer. Zorg ervoor dat de E-buffer op kamertemperatuur is voordat u elektroporeert. Steek de buis in het station en duw hem naar beneden totdat hij vastklikt.
- Aliquot voor elke reactie 2,5 μL sgRNA in een concentratie van 1.100 ng/μL. Verdun het sgRNA in koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,9 mM CaCl2 en 0,5 mM MgCl2 (PBS + Ca/Mg). Laat het op ijs staan.
- Bereid twee platen voor: een ongecoate plaat met 12 putjes voor de cellen en een extra plaat met 24 putjes om de kweekmedia in te bewaren. Aliquot 1,5 ml antibioticavrij medium per reactie in de putjes van de plaat met 24 putjes.
- Bereid Cas9-eiwit voor. Er zijn verschillende commerciële en academische leveranciers van steriel gezuiverd Cas9-eiwit. Verdun Cas9 tot een eindconcentratie van 20 μM met koud PBS + Ca/Mg. Voor elke elektroporatiereactie aliquot 1 μL 20 μM Cas9 in steriele PCR-buisjes. Laat op ijs staan.
- Bereid de cellen voor op elektroporatie.
- Verwijder het groeimedium. Was de cellen met PBS zonder CaCl2 en MgCl2 (PBS-Ca/Mg) om het serum en tweewaardige kationen te verwijderen die de hechting bevorderen. Voeg vervolgens PBS + 1 mM EDTA toe en incubeer ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur totdat de cellen beginnen los te laten.
- Pipeteer voorzichtig op en neer om de cellen los te maken. Breng de cellen over naar een eiwitarm bindend buisje van 15 ml. Pelleteer de cellen op 500 x g gedurende 5 min.
OPMERKING: Macrofagen hechten zich aan plastic. Het gebruik van eiwitarme centrifugebuisjes verbetert de celopbrengst aanzienlijk. - Werk snel om langdurige incubatie van cellen in PBS + EDTA te voorkomen. Verwijder het grootste deel van het supernatant en laat ongeveer 1 ml supernatant in de buis. Resuspendeer de cellen in de resterende supernatant en breng ze vervolgens over naar een laag eiwitbindende microfuge-buis van 1,5 ml.
- Verwijder een klein aliquotum cellen om te tellen. Pelleteer de resterende cellen door 5 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur te centrifugeren.
- Tel tijdens het centrifugeren de cellen en verwarm de Cas9- en sgRNA-buisjes tot kamertemperatuur.
- Verwijder al het supernatans uit de celkorrel. Resuspendeer de cellen in PBS + Ca/Mg in een concentratie van 4 x 107 cellen/ml (4 x 105 cellen per 10 μL reactie).
NOTITIE: Elke kit wordt geleverd met een beperkte hoeveelheid elektroporatiebuffer (Buffer R, Buffer T). We vinden echter dat de elektroporatie-efficiëntie met behulp van PBS + Ca/Mg gelijk is aan de gepatenteerde buffers. - Bij het elektropoleren van sgRNA's voor verschillende genen, aliquot de cellen in verschillende lage eiwitbindende buizen voor elk gen om kruisbesmetting tussen de sgRNA's te voorkomen. Bewaar de cellen op kamertemperatuur totdat ze klaar zijn voor elektroporatie.
4. RNP-assemblage
- Bewaar het sgRNA en Cas9 op kamertemperatuur om neerslag te voorkomen. Voeg 2,5 μL sgRNA toe aan 1 μL van het verdunde Cas9 in gesteriliseerde PCR-buisjes. Doseer het sgRNA langzaam gedurende 15 s met mengen om neerslag te voorkomen.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van het RNP-complex mogelijk te maken.
5. RNP-levering door elektroporatie
- Bereid de elektroporatietip (cuvette) voor. Druk de zuiger in om de steel uit te schuiven. Steek de steel in de punt.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de punt goed vastzit en dat de plunjer soepel glijdt en buiten de punthuls uitsteekt. Als de punt niet goed is geplaatst, kunnen er luchtbellen in de punt komen, waardoor de punt defect raakt. - Resuspendeer de cellen door op en neer te pipetteren en laad vervolgens de elektroporatietip met de cellen. Trek de volledige volumecapaciteit van 10 μL van de punt op en vermijd luchtbellen.
- Begin met de negatieve controle-sgRNA en breng 10 μL cellen in de elektroporatietip over naar de monsterbuis met 3,5 μL RNP uit stap 4. Pipetteer drie keer op en neer om goed te mengen. Zuig 10 μL van het mengsel terug in de punt en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
- Plaats de punt in het elektroporatiestation en laat hem in de buffer zakken. Vermijd contact met plastic oppervlakken met de punt om de steriliteit te behouden. Druk op Start op het aanraakscherm.
- Na voltooiing geeft het display een succesvolle puls aan. Haal de pipet uit het apparaat en plaats de cellen in een droog bakje van de gelabelde, ongecoate plaat met 12 putjes.
- Spoel de pipet twee keer op en neer in 15 ml PBS + Ca/Mg. Leg de pipet opzij met de punt er nog aan. Zorg ervoor dat de punt niets raakt en steriel blijft.
OPMERKING: In veel experimenten is het mogelijk om de tip opnieuw te gebruiken voor meerdere monsters, zoals na het inactieve negatieve controle-sgRNA-monster, of tijdens de eerste evaluaties van de gidsactiviteit wanneer vier tot vijf sgRNA's per gen worden getest en de enige uitlezing de bewerkingsefficiëntie is. Tijdens functionele analyse op bewerkte cellen wordt echter voor elk gen een nieuwe tip aanbevolen, omdat kleine hoeveelheden sgRNA of celoverdracht de experimentele resultaten kunnen beïnvloeden. - Voeg onmiddellijk 1 ml antibioticavrij medium (vermeld in stap 3.6) toe aan de cellen en schud voorzichtig met de plaat om te mengen.
- Herhaal stap 5.2-5.6 voor de overige reacties.
- Plaats de cellen terug in de couveuse.
- Controleer de levensvatbaarheid van de cellen 1-2 uur na elektroporatie. De cellen moeten >90% hechten. Optioneel: Voeg gentamicine (5 μg/ml) 1-2 uur na elektroporatie toe aan de cellen om besmetting te helpen voorkomen als dit de stroomafwaartse experimenten niet verstoort.
6. Beoordeling van de bewerkingsefficiëntie
OPMERKING: De meeste bewerkingen zijn na 48 uur voltooid.
- Controleer de monolaag van de cel 48 uur na elektroporatie. Als de cellen voor meer dan 50% samenvloeien, ga dan verder. Als de cellen <50% confluent zijn, wacht dan nog eens 1-2 dagen. De genomische DNA-analyse om de bewerkingsefficiëntie te bepalen, vereist 1 x 105 cellen, naast de cellen die nodig zijn voor het stroomafwaartse experiment.
- Bereid genoom-DNA (gDNA) voor.
- Was de cellen met PBS(-Ca/Mg). Voeg 1 ml PBS + 1 mM EDTA toe. Incubeer ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur totdat de cellen beginnen los te komen van de plaat.
- Maak de cellen los door te pipetteren. Breng over naar een eiwitarme microfuge-buis.
- Tel de cellen en verwijder een aliquot van 1 x 105 cellen. De resterende cellen kunnen opnieuw worden geplateerd voor gebruik in verdere experimenten. Over het algemeen worden de experimenten 5 dagen na elektroporatie uitgevoerd om verval van het eiwit mogelijk te maken.
- Pellet de cellen voor gDNA-analyse gedurende 15 s op maximale snelheid in een microfugebuis.
- Resuspendeer de pellet in 50 μL lysisbuffer. Vortex om alle cellen los te maken die aan de wanden van de buis vastzitten, en verwarm gedurende 10 minuten bij 98 °C om de cellen te lyseren en endogene DNase te inactiveren.
- Leg de buisjes op ijs.
- Voeg 1 μL proteïnase K (20 mg/ml) toe. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C; Het kan voor het gemak een nacht blijven staan.
- Verwarm gedurende 10 minuten tot 98 °C om de proteïnase K te inactiveren.
- Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op maximale snelheid. Verwijder het supernatant, dat het DNA bevat. Dit ruwe preparaat zonder verdere zuivering werkt goed voor de meeste PCR-reacties.
- Evalueer de bewerkingsefficiëntie met Sanger-sequencing.
- Ontwerp PCR-primers 200-300 bp stroomopwaarts van de meeste 5'-gidslocaties en 200-300 bp stroomafwaarts van de meest 3'-gidsplaatsen. De typische amplicongrootte is ~500 bp. Ontwerp een geneste sequencingprimer op ten minste 125 bp afstand van de dichtstbijzijnde geleidingsplaats (Figuur 2A).
- Voer PCR uit met behulp van 2 μL gDNA.
- Bereid het PCR-product voor op sequencing. Dit protocol maakt gebruik van een exonuclease I/garnalen alkalische fosfatase (ExoI/SAP) behandeling. Commerciële DNA-zuiveringskits werken ook, maar vereisen meer hands-on tijd.
- Bereid 15 μL van het PCR-product. Voeg 7,5 μL water, 1 μL 10x ExoI-buffer, 10 U ExoI en 1 U SAP toe om de dNTP's en primers af te breken die de Sanger-sequencing verstoren.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min, gevolgd door 85 °C gedurende 20 min om de enzymen te deactiveren.
- Sanger-sequencing uitvoeren op het met Exo/SAP behandelde PCR-product; gebruik een bekende hoeveelheid DNA-groottemarker om de grootte van het PCR-product in het monster te schatten. De sequentiereacties moeten mogelijk worden geoptimaliseerd, omdat de TIDE-software sequentiechromatogrammen van hoge kwaliteit nodig heeft om de bewerkingsefficiëntie nauwkeurig in te schatten. Het sequentiechromatogram voor de onbewerkte locus moet duidelijke pieken opleveren met een minimale achtergrond (Figuur 2B, C).
- Om de bewerkingsefficiëntie te schatten, gebruikt u TIDE om de Sanger-sequencingchromatogrambestanden te analyseren met behulp van het bewerkte gDNA en het onbewerkte controle-gDNA. (Tabel 1, figuur 2). Upload de Sanger-sequencingbestanden en voer de software uit met de standaardinstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De IVT-template is een PCR-product van 127 bp (Figuur 1B). Het IVT-product van volledige lengte is een 98 nt RNA, dat op dezelfde manier migreert als een dubbelstrengs DNA-fragment van 70 bp (Figuur 1C).
Na elektroporatie zouden de cellen >90% levensvatbaar moeten zijn, met een totaal celgetal van >70% van het startcelaantal. De resulterende pool van gemuteerde cellen zou een diverse set indels moeten hebben, beginnend in de buurt van de Cas9-splitsingsplaats. De analyse van de beoogde genen door middel van PCR- en Sanger-sequencing moet meerdere nucleotiden aantonen op elke positie stroomafwaarts van de Cas9-splitsingsplaats (Figuur 2).
Figuur 1: Overzicht van het sgRNA-Cas9 bewerkingsproces. (A) Schema voor het ontwerp van de gids, de sgRNA-generatie en de Cas9-sgRNA-afgifte. (B) Het PCR-product van IVT voor Src sgRNA's 1, 2 en 3 opgelost op een agarosegel van 2%. De pijl geeft de juiste 127 bp PCR-producten aan. (C) De RNA-producten na IVT voor Src sgRNA's 1, 2 en 3 opgelost op een agarosegel van 2%. De haakjes geven de juiste sgRNA-producten aan. De variabele migratie van het sgRNA is te wijten aan de secundaire structuur van het RNA. Dit cijfer is overgenomen uit de masterscriptie van de eerste auteur16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Hoge bewerkingsefficiëntie bereikt voor meerdere gerichte genen. (A) Schema van PCR- en Sanger-sequencingprimers. (B) Schema van de workflow voor TIDE om de bewerkingsefficiëntie te beoordelen. (C) Representatief Sanger-sequentiechromatogram van de ROSA26-locus van BMDM's geëlektropoleerd met een controle-niet-gericht sgRNA-Cas9 RNP (boven) en ROSA26-specifiek sgRNA (onder); de Cas9-splitsingsplaats is gemarkeerd. De TIDE-uitvoer (rechts) met de berekende bewerkingsefficiëntie en het percentage sequenties dat het aangegeven aantal indels herbergt. (D,E) Sanger-sequentiechromatogrammen van de (D) Src - en Cblb-genen in de bewerkte BMDM's. Dit cijfer is overgenomen uit de masterscriptie van de eerste auteur16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 3: Matige toename van de bewerkingsefficiëntie dankzij de commerciële elektroporatieverbeteraar. De BMDM's werden geëlektropoleerd met laag-efficiënte gidsen om het effect van een commerciële bewerkingsversterker te evalueren. Voorafgaand aan de elektroporatie werd 1 μL van de enhancer toegevoegd aan de geassembleerde RNP's tot een eindconcentratie van 4 μM. De bewerkingsefficiëntie van het aangegeven Src-sgRNA werd geëvalueerd met behulp van TIDE. Dit cijfer is overgenomen uit de masterscriptie van de eerste auteur16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam van de tool | URL | ||
| Synthego - CRISPR-ontwerptool | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| Het Brede Instituut - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| Traceren van Indels door ontleding (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Tabel 1: URL's van online tools.
| Primer Naam | Volgorde | ||
| Gids-specifieke primer | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| Gids-Specifieke Primer - Cbl-b Gids 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| Gids-Specifieke Primer - Cbl-b Gids 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| Gids-specifieke primer - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGATgttttagagctagaa | ||
| Gids-specifieke primer - Scramble | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| Gids-Specifieke Primer - Src Gids 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| Gids-Specifieke Primer - Src Gids 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| Gids-Specifieke Primer - Src Gids 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 Omgekeerde Lange Universele Primer | aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac | ||
| Universele Forward Amplification Primer | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| Universele Reverse Amplification Primer | aaaaaagcaccgactcgg | ||
Tabel 2: Oligonucleotiden die in de PCR worden gebruikt om de sjabloon voor de IVT van het sgRNA te genereren. De 20 nucleotide-doelsequenties voor genspecifieke primers worden met een hoofdletter geschreven.
| BMDM Groei media. Bewaren bij 4 C. | |||
| DMEM | |||
| Foetaal runderserum | 0.1 | ||
| L-glutamine | 0,2 miljoen | ||
| MCSF-supernatans van 3T3-MCSF-cellen** | 0.1 | ||
| Natriumpyruvaat | 11 mg/ml | ||
| Lysis Buffer. Bewaren bij 4 C. | |||
| 2-mercaptoethanol (direct voor gebruik toevoegen) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 mM | ||
| Tris | 20 mM | ||
| Triton-X 100 | 0.005 | ||
| **3T3-MCSF-cellen worden gekweekt in DMEM+10% FCS. Supernatent met MCSF wordt geoogst op de 5e dag na het bereiken van 100% samenvloeiing. Als alternatief kan 10ng/ml recombinant MCSF worden gebruikt in plaats van geconditioneerde media | |||
Tabel 3: Samenstellingen van de media en buffers.
Aanvullend bestand 1: Onbewerkt sequencing-bestand voor ROSA_ Mock Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Onbewerkt sequencingbestand voor ROSA_TargettingGuide Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: Onbewerkt sequencingbestand voor ScrambleGuide Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 4: Onbewerkt sequencingbestand voor SrcG5+SrcG6 Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 5: Onbewerkt sequencingbestand voor CBLB_Mock Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 6: Onbewerkt sequencingbestand voor CBLB_TargetingGuide Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 7: Onbewerkt sequencingbestand voor Mock_Guide2Locus Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 8: Onbewerkt sequencingbestand voor Mock_Guide6Locus Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 9: Onbewerkt sequencingbestand voor SrcGuide2_Enhancer Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 10: Onbewerkt sequencingbestand voor SrcGuide2_NoEnhance Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 11: Onbewerkt sequencingbestand voor SrcGuide6_Enhancer Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 12: Onbewerkt sequencingbestand voor SrcGuide6_NoEnhancer Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genoombewerking met behulp van geëlektropoleerde Cas9-sgRNA-complexen maakt een effectieve verstoring van de genfunctie in BMDM's mogelijk. De bewerkingsefficiëntie varieert afhankelijk van de doelsequentie en het gen. Doorgaans worden over het algemeen vier tot vijf sgRNA's gescreend om er een te identificeren die zeer actief is. Sommige loci hebben een lagere bewerkingsefficiëntie, hoogstwaarschijnlijk vanwege de chromatinestructuur. In deze gevallen kunnen verschillende wijzigingen worden aangebracht om de bewerkingsefficiëntie te verhogen. Gelijktijdige afgifte van twee actieve sgRNA's aan hetzelfde exon resulteert in een verbeterde bewerking voor sommige genen. Wanneer echter twee geleiders samen worden getransfecteerd, hebben we waargenomen dat TIDE aan nauwkeurigheid kan inboeten. Daarom kunnen alternatieve technieken nodig zijn om bewerkingen te beoordelen, zoals Western blotting. Bovendien verhoogt de opname van een in de handel verkrijgbare NHEJ-versterker vaak de bewerkingsefficiëntie met ~20% (Figuur 3).
Deze aanpak heeft verschillende voordelen. De directe afgifte van sgRNA-Cas9 aan cellen vereist niet de tijdrovende stappen van plasmideconstructie of lentivirale vectorproductie om BMDM's te transduceren. Het proces van het synthetiseren van sgRNA, elektroporatie en het genereren van mutante cellen kan in 1 week worden voltooid. Deze techniek kan ook worden gebruikt met BMDM's die zijn afgeleid van genetisch gemodificeerde muizen om dubbelgemuteerde cellen te maken. Hoewel er chemische methoden bestaan voor het transfecteren van primaire immuuncellen met siRNA of mRNA17, zijn deze chemische methoden aanzienlijk minder effectief dan elektroporatie bij het afleveren van Cas9-sgRNA-complexen aan immuuncellen18. Er zijn verschillende soorten elektroporatieapparaten in de handel verkrijgbaar. Verwacht wordt dat deze apparaten op dezelfde manier zullen werken voor de levering van Cas9-sgRNA-complexen, hoewel de spanningsparameters waarschijnlijk voor elk afzonderlijk apparaat moeten worden geoptimaliseerd. Hoewel dit protocol voornamelijk is gebruikt bij BMDM's van muizen, zijn in beperkte experimenten vergelijkbare resultaten verkregen met BMDM's van ratten (niet-gepubliceerde gegevens). Het is mogelijk dat andere soorten primaire macrofagen, zoals peritoneale macrofagen van muizen of alveolaire macrofagen, ook geschikt zijn voor deze benadering, hoewel dit nog niet is getest.
Deze methode heeft enkele beperkingen. Het aantal cellen dat door dit protocol wordt geproduceerd, is enigszins beperkt; Onze standaardcondities genereren 4 x 105 cellen per elektroporatie. Het is echter mogelijk om de opbrengst aanzienlijk op te schalen, aangezien de efficiëntie onverminderd is in een reactie van 10 μL met maximaal 2,4 x 106 cellen met dezelfde hoeveelheid RNP (niet-gepubliceerde gegevens). Daarnaast zijn er elektroporatietips van 100 μL verkrijgbaar. Een ander nadeel van deze methode zijn de kosten; De kosten van zowel de elektroporator als de elektroporatie verbruiksartikelen zijn aanzienlijk. Deze kosten kunnen aanzienlijk worden verzacht door de tips te hergebruiken bij het gebruik van verschillende sgRNA's die zich op hetzelfde gen richten en door PBS te gebruiken in plaats van de propriëtaire buffers. Hoewel de samenstelling van de propriëtaire buffers niet bekend is, benadert vermoedelijk de elektrolytsamenstelling van PBS met 0,9 mM CaCl2 en 0,5 mM MgCl2 de elektrische geleidbaarheid van de propriëtaire buffer. Deze wijzigingen verlagen de kosten van verbruiksartikelen met ongeveer 80% in dit protocol.
Er zijn verschillende cruciale stappen in het protocol, waarvan afwijkingen de efficiëntie van de genbewerking dramatisch kunnen beïnvloeden. Een van de mogelijke valkuilen is dat standaard IVT-kits, die niet zijn ontworpen voor hoge opbrengsten, vaak onvoldoende IVT-producten produceren. Bovendien kan het gebruik van standaard polypropyleen microfuge-buizen in plaats van buizen met een lage binding aanzienlijk celverlies door hechting veroorzaken. De onvolledige defosforylering van het IVT-product en de aanwezigheid van resterend DNA in het sgRNA-preparaat kunnen leiden tot de activering van macrofaag-immuunsensoren en de daaropvolgende toxiciteit. Hogere of langere spanningspulsen kunnen ook leiden tot verhoogde celdood.
Samengevat is dit genoombewerkingsprotocol, dat elektroporatie gebruikt om Cas9-sgRNA RNP's af te leveren, een efficiënte methode om genen in BMDM's van muizen te verstoren. Dit stelt gebruikers in staat om snel te screenen op fenotypes in primaire cellen die de complexe biologie van macrofagen in vivo beter samenvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de NIH-subsidie 5R01AI144149. De schematische figuren zijn gemaakt met BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , Master's thesis (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
