Summary
Bu protokol, in vitro olarak bir araya getirilen ve elektroporasyon yoluyla iletilen Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksleri kullanılarak fare kemik iliği türevi makrofajlarda genom düzenleme prosedürünü açıklar.
Abstract
Farelerden elde edilen kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM'ler), doku makrofajlarının karmaşık biyolojisini incelemek için önemli bir araçtır. Birincil hücreler olarak, makrofajların fizyolojisini in vivo olarak ölümsüzleştirilmiş makrofaj hücre dizilerinden daha yakından modellerler ve halihazırda tanımlanmış genetik değişiklikleri taşıyan farelerden türetilebilirler. Bununla birlikte, BMDM'lerde gen fonksiyonunu bozmak teknik olarak zor olmaya devam etmektedir. Burada, BMDM'lerde verimli CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi için bir protokol sunuyoruz, bu da gen fonksiyonunu bozan çerçeve kayması mutasyonlarıyla sonuçlanan küçük eklemelerin ve delesyonların (indels) kullanılmasına izin veriyor. Protokol, tek kılavuzlu RNA'ların (sgRNA-Cas9) nasıl sentezleneceğini ve elektroporasyon yoluyla verilebilen saflaştırılmış sgRNA-Cas9 ribonükleoprotein komplekslerinin (RNP'ler) nasıl oluşturulacağını açıklar. Ayrıca, rutin Sanger dizileme ve ücretsiz olarak kullanılabilen bir çevrimiçi analiz programı kullanarak düzenleme verimliliğini izlemek için etkili bir yöntem sağlar. Protokol 1 hafta içinde yapılabilir ve plazmit yapımı gerektirmez; Genellikle %85 ila %95 düzenleme verimliliği sağlar.
Introduction
Makrofajlar, doku onarımı ve bağışıklıktakritik rol oynayan doğuştan gelen bağışıklık hücreleridir 1,2. Fare RAW 264.7 hücreleri veya insan THP-1 hücreleri gibi ölümsüzleştirilmiş makrofaj hücre hatları, RNA girişimi veya CRISPR/Cas9 3,4 için vektörler sağlayarak sağlam büyüme ve gen bozulması kolaylığı dahil olmak üzere çeşitli faydalı özelliklere sahiptir. Bununla birlikte, onkojenik transformasyon fizyolojilerini önemli ölçüde değiştirir, bu da bazı yolların anormal aktivasyonuna ve diğerlerinin sessiz tepkilerine neden olur 5,6. Primer kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM'ler) in vivo makrofaj fizyolojisini daha yakından özetler, ancak bu primer immün hücrelerde hem plazmit transfeksiyonunun hem de viral transdüksiyonun düşük etkinliği nedeniyle genetik olarak manipüle edilmesi zor olmaya devam etmektedir 7,8. Bu nedenle, gen fonksiyonunu bozmak için daha verimli yöntemlere ihtiyaç vardır.
CRISPR/Cas9 genom düzenleme, memeli hücreleri 9,10,11,12 dahil olmak üzere bir dizi biyolojik sistemde genetik manipülasyon için güçlü bir araçtır. Streptococcus pyogenes Cas9 proteini, diziye özgü bir kılavuz RNA ile kompleks haline getirildiğinde çift sarmallı DNA'yı verimli ve spesifik olarak parçalar. Bölünmüş DNA'nın homolog olmayan uç birleşmesi (NHEJ) yoluyla DNA onarımı, çerçeve kayması mutasyonları oluşturan küçük eklemeler veya delesyonlar (indels) ile sonuçlanır. Erken çalışmalarda, Cas9 ve sgRNA'lar, birçok hücre hattı için etkili dağıtım yöntemleri olan plazmit veya lentiviral vektörler yoluyla verildi 9,10. Bununla birlikte, birincil hücreler ve özellikle birincil bağışıklık hücreleri, transfeksiyon veya transdüksiyon yoluyla vektör iletiminin düşük verimliliği nedeniyle genellikle bu yöntemlere dirençlidir. Daha sonra, in vitro olarak sgRNA-Cas9 kompleksleri oluşturmak ve bunları elektroporasyon yoluyla vermek için yöntemler geliştirilmiş ve bu yöntemler çeşitli hücre tiplerinde yüksek verimlilik sağlamıştır13,14. Sonuçlar, primer makrofajlarda genom düzenlemesi yapmak için bu yaklaşımı kullanma olasılığını ortaya koymuştur.
Burada, birincil BMDM'lerde genom düzenlemesi yapmak için sgRNA-Cas9 ribonükleoprotein komplekslerini (RNP'ler) kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Birincil bağışıklık hücrelerinde bulunan bağışıklık sensörlerinin aktivasyonunu azaltmak için adımlar içerir ve minimum toksisite ile hedeflenen lokuslarda %95'e kadar düzenleme ile sonuçlanır. Bu protokol aynı zamanda rutin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve Sanger dizilemesi kullanarak düzenleme verimliliğini değerlendirmek için iş akışlarını ve ardından iyi doğrulanmış bir çevrimiçi yazılım aracı olan Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15 ile in silico analizi içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA tasarımı
NOT: Bu adım, hedef dizilerin seçimini ve sgRNA'ların tasarımını açıklar. İlk büyük kodlama ekzonunda bulunan kılavuzları tasarlamak yararlıdır, böylece çevrilmiş herhangi bir protein açık okuma çerçevesinin başlarında bozulur. Aynı ekzon içinde yer alan hedef dizileri seçmek de yararlıdır, çünkü bu, düzenleme verimliliğinin analizini kolaylaştıracaktır (6. adım). Bu protokolle sağlanan genom düzenleme örnekleri, Src geninin ve Cblb geninin ilk eksonunu ve ayrıca fare genomunun kodlamayan Rosa26 lokusunu hedefleyen sgRNA'ları kullandı.
- Birkaç ücretsiz çevrimiçi tasarım aracından birini kullanarak hedeflenecek 20 nükleotid genomik dizisini tanımlayın (Tablo 1). Cas9 aktivitesi seçilen spesifik kılavuza göre değiştiğinden ve oldukça aktif bir kılavuzun önceden tahmini mümkün olmadığından, her gen içinde örtüşmeyen dört ila beş kılavuz seçin.
NOT: Kılavuzun hedeflenen yerin sırasına göre doğru yönlendirilmesini sağlamak çok önemlidir. Tasarım araçları, hangi kromozomal zincirin hedeflendiğine bakılmaksızın, kılavuz dizisini tipik olarak 5' ila 3' oryantasyonda sağlar. İplik oryantasyonunu doğrulamak için, hedeflenen genomik dizinin hemen 3' S. pyogenes Cas9 (nGG) için bir protospacer bitişik motif (PAM) dizisi olup olmadığını kontrol edin. sgRNA dizisi PAM'yi içermez.
2. sgRNA sentezi
NOT: Bu adım, in vitro transkripsiyon (IVT) için bir şablon oluşturmak üzere PCR kullanılarak sgRNA'ların nasıl sentezleneceğini ve ardından spin kolonları kullanılarak sgRNA'nın nasıl saflaştırılacağını açıklar (Şekil 1A). Özel sentetik sgRNA'lar, PCR/IVT'ye alternatif olarak çeşitli satıcılar aracılığıyla ticari olarak temin edilebilir.
- T7 RNA polimeraz için IVT şablonunu oluşturmak için PCR gerçekleştirin. PCR reaksiyonu, gene özgü kılavuz dizisine sahip kısa bireysel primerlere ek olarak, bir T7 RNA polimeraz promotörü ve trans-aktive edici CRISPR RNA (tracrRNA) dizisi (Tablo 2) içeren evrensel primerler kullanır.
- Bu, yükseltilmeyen örtüşme genişletme adımıdır. PCR tamponunu 1x'e seyreltin ve ilave 1 mM MgCl2 ekleyin. Ardından, toplam 46 μL hacme 0,25 μL yüksek kaliteli DNA polimeraz, 0,5 mM deoksinükleotid trifosfat (dNTP), 0,02 mM kılavuza özgü astar ve 0,02 mM T7 ters uzun üniversal primer (Tablo 2) ekleyin. Ardından, tüpü termocycler'a yerleştirin ve iki döngü çalıştırın: 15 saniye boyunca 95 °C, 15 saniye boyunca 37 °C ve 15 saniye boyunca 72 °C. Reaksiyonları buz üzerinde soğutun.
- Bu, PCR amplifikasyon adımıdır. Her reaksiyona 2 μL 25 mM ileri amplifikasyon primeri ve 2 μL 25 mM ters amplifikasyon primeri ekleyin. Son reaksiyon hacmi 50 μL'dir. 95 °C'de 30 saniye denatüre edin. Ardından, 35 döngü çalıştırın: 95 saniye boyunca 15 °C, 65 saniye boyunca 20 °C ve 72 °C 15 saniye boyunca. 72 °C'de 2 dakika boyunca ek bir uzatma gerçekleştirin.
- PCR reaksiyon ürününü %2'lik bir agaroz jel üzerinde kontrol edin. Örtüşme-uzatma PCR, gene özgü 20 nükleotid kılavuzunun yukarı akışında T7 promotörü ve hemen aşağı akışta tracrRNA ile 127 bp dsDNA molekülü ile sonuçlanır (Şekil 1B).
- IVT şablonu saflaştırma: Bunun için iyi çalışan çok sayıda protokol ve kit vardır. Bu protokol, katı faz tersinir immobilizasyon (SPRI) boncukları kullanır. 50 μL PCR ürününü 90 μL boncukla karıştırın ve üreticinin talimatlarını izleyin. 40 μL tampon (5 mM Tris, 0.1 mM etilendiamintetraasetik asit [EDTA]) ekleyerek DNA'yı yükseltin ve 65 °C'de 5 dakika ısıtın.
- 260 nm dalga boyunda absorpsiyon kullanarak IVT şablonunun DNA konsantrasyonunu ölçün. IVT için en az 50 ng/μL'lik bir DNA konsantrasyonu gereklidir. IVT şablonu -20 °C'de saklanabilir.
- IVT reaksiyonu
- Yüksek IVT verimi üretmek için tasarlanmış ticari bir kit kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). IVT reaksiyonunu gerçekleştirmek için üreticinin tavsiyelerine uyun. 20 μL'lik bir reaksiyonda 250 ng IVT şablonu kullanarak, 37 ° C'de 4-16 saat inkübe edin.
- %2'lik bir agaroz jel üzerinde 1 μL reaksiyon çalıştırarak IVT sgRNA ürününü kontrol edin. 70 bp dsDNA'ya benzer şekilde çalışan parlak bir RNA bandı gözlemlenmelidir (Şekil 1C). Zorunlu olmamakla birlikte, keskin ve daha çözülmüş bantlar elde etmek için, üre içeren bir RNA numune tamponu kullanın ve numuneyi yüklemeden önce 5 dakika boyunca 65 °C'de denatüre edin.
NOT: RNA ikincil yapısındaki farklılıklar nedeniyle bazı kılavuz RNA'larda soluk yüksek moleküler ağırlık bantları ve hafif migrasyon farklılıkları görülebilir.
- RIG-I'in (yabancı bir RNA sensörü) aktivasyonunu ve ardından elektroporasyonu takiben hücre ölümünü en aza indirmek için sgRNA IVT ürününü fosforile edin. Her 20 μL IVT reaksiyonu için, 1x CIP tamponuna 69 μL moleküler dereceli su ve 15 U buzağı bağırsak fosfataz (CIP) ekleyin. 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
- Elektroporasyondan sonra hücre ölümünü tetikleyen hücresel DNA sensörlerinin aktivasyonunu en aza indirmek için IVT şablonunu bozun. Her IVT reaksiyonuna 2 U RNaz içermeyen DNaz ekleyin. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. IVT ürünü -20 °C'de 1 gün veya -80 °C'de birkaç ay saklanabilir.
- Döndürme sütunlarını kullanarak IVT ürününü saflaştırın. Bu adım için, SPRI boncuk saflaştırma kitleri daha düşüktür.
- IVT ürününe 220 μL bağlayıcı tampon ve ardından 1 mL %100 moleküler biyoloji sınıfı etanol ekleyerek RNA'yı kolona bağlayın. İyice karıştırın ve sütunu yükleyin. Daha sonra, üreticinin talimatlarını izleyin. sgRNA'nın kontaminasyonunu önlemek için son yıkamayı laminer akışlı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
- Kontaminasyonu önlemek için elüsyonu laminer akış başlığında gerçekleştirin. 30 μL steril 10 mM Tris tamponu (pH 8.0) kullanarak RNA'yı elute edin.
- 260 nm dalga boyunda absorbansı ölçerek sgRNA konsantrasyonunu ölçün.
NOT: Tipik sgRNA verimleri en az 100 μg'dir. - sgRNA'yı -80 °C'de saklayın. Üçten fazla donma-çözülme döngüsünden kaçınmak için alikotlar yapın.
3. Elektroporasyon için hazırlık
NOT: Kontaminasyonu önlemek için tüm adımlar laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir. Bu protokol, 10 μL uçlara sahip ticari olarak temin edilebilen bir elektroporasyon sistemi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanır.
- BMDM'leri kullanmadan 48-72 saat önce çözdürün ve doku kültürü (TC) ile muamele edilmemiş plakalarda genişletin.
NOT: Reaksiyon başına 4 x 105 hücre gereklidir. - Reaksiyon montajı için PCR tüplerini sterilize edin. Reaksiyon başına bir PCR tüpü hazırlayın ve bunları bir termodöngüleyicide 98 °C'de 10 dakika ısıtın. Tüpleri gruplar halinde hazırlayın ve kapalı olarak saklayın. Kullanıma hazır olduğunuzda sterilize edilmiş PCR tüplerini buzun üzerine yerleştirin.
- Pipet istasyonunu %70 etanol ile temizleyin ve laminer akış başlığına yerleştirin. Parametreleri 1.900 V, 20 ms ve bir darbe olarak ayarlayın.
- Steril tutmak için bir transfeksiyon tüpünü paketten dikkatli bir şekilde çıkarın ve 3 mL "E" tamponu ile doldurun. Elektroporasyondan önce E tamponunun oda sıcaklığında olduğundan emin olun. Tüpü istasyona yerleştirin ve tık sesi gelene kadar aşağı doğru itin.
- Her reaksiyon için, 1.100 ng/μL konsantrasyonda 2.5 μL sgRNA'yı alikotlayın. sgRNA'yı soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 0.9 mM CaCl2 ve 0.5 mM MgCl2 (PBS + Ca / Mg) ile seyreltin. Buz üzerinde bırakın.
- İki plaka hazırlayın: hücreler için 12 oyuklu kaplanmamış bir plaka ve kültür ortamını tutmak için ek bir 24 oyuklu plaka. 24 oyuklu plakanın kuyucuklarına reaksiyon başına 1.5 mL antibiyotiksiz ortam aliquot.
- Cas9 proteinini hazırlayın. Steril saflaştırılmış Cas9 proteininin birkaç ticari ve akademik tedarikçisi vardır. Cas9'u soğuk PBS + Ca / Mg ile 20 μM'lik bir son konsantrasyona seyreltin. Her elektroporasyon reaksiyonu için, 1 μL 20 μM Cas9'u steril PCR tüplerine ayırın. Buz üzerinde bırakın.
- Hücreleri elektroporasyon için hazırlayın.
- Büyüme ortamını çıkarın. Yapışmayı destekleyen serum ve iki değerlikli katyonları çıkarmak için hücreleri CaCl2 ve MgCl2 (PBS-Ca / Mg) olmadan PBS kullanarak yıkayın. Daha sonra PBS + 1 mM EDTA ekleyin ve hücreler ayrılmaya başlayana kadar oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika inkübe edin.
- Hücreleri ayırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri düşük protein bağlayıcı 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'da pelet haline getirin.
NOT: Makrofajlar plastik eşyalara yapışıktır. Düşük protein bağlayıcı santrifüj tüplerinin kullanılması, hücre verimini önemli ölçüde artırır. - PBS + EDTA'da hücrelerin uzun süreli inkübasyonunu önlemek için hızlı çalışın. Süpernatantın çoğunu çıkarın, tüpte yaklaşık 1 mL süpernatan bırakın. Kalan süpernatanttaki hücreleri yeniden süspanse edin ve daha sonra düşük protein bağlayıcı 1.5 ml'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın.
- Sayılacak küçük bir hücre alikotunu çıkarın. Kalan hücreleri 5 dakika oda sıcaklığında 500 x g'da santrifüjleyerek pelet haline getirin.
- Santrifüjleme sırasında hücreleri sayın ve Cas9 ve sgRNA tüplerini oda sıcaklığına ısıtın.
- Tüm süpernatanı hücre peletinden çıkarın. Hücreleri PBS + Ca/Mg'de 4 x 107 hücre/mL konsantrasyonda (10 μL reaksiyon başına 4 x 105 hücre) yeniden süspanse edin.
NOT: Her kit, sınırlı miktarda elektroporasyon tamponu (Tampon R, Tampon T) ile birlikte verilir. Bununla birlikte, PBS + Ca/Mg kullanarak elektroporasyon verimliliğinin tescilli tamponlara eşdeğer olduğunu bulduk. - Farklı genler için sgRNA'ları elektropoze ederken, sgRNA'lar arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için hücreleri her gen için farklı düşük protein bağlayıcı tüplere ayırın. Elektroporasyona hazır olana kadar hücreleri oda sıcaklığında tutun.
4. RNP montajı
- Çökelmeyi önlemek için sgRNA ve Cas9'u oda sıcaklığında tutun. Sterilize edilmiş PCR tüplerinde 1 μL seyreltilmiş Cas9'a 2,5 μL sgRNA ekleyin. Çökelmeyi önlemek için sgRNA'yı 15 saniye boyunca yavaşça karıştırın.
- RNP kompleksi oluşumuna izin vermek için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
5. Elektroporasyon ile RNP iletimi
- Elektroporasyon ucunu (küvet) hazırlayın. Gövdeyi uzatmak için pistona basın. Sapı uca yerleştirin.
NOT: Ucun sağlam olduğundan ve pistonun düzgün bir şekilde kaydığından ve uç kılıfının ötesine uzandığından emin olun. Uç doğru şekilde yerleştirilmezse, uca hava kabarcıkları girebilir ve bu da uç arızasına neden olabilir. - Yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yeniden askıya alın ve ardından elektroporasyon ucunu hücrelere yükleyin. Kabarcıkları önleyerek ucun 10 μL'lik hacim kapasitesinin tamamını geri çekin.
- Negatif kontrol sgRNA'sından başlayarak, elektroporasyon ucundaki 10 μL hücreyi, 4. adımdan itibaren 3,5 μL RNP içeren numune tüpüne aktarın. İyice karıştırmak için üç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Karışımın 10 μL'sini tekrar uca çekin ve kabarcık olmadığından emin olun.
- Ucu elektroporasyon istasyonuna yerleştirin ve tampona indirin. Steriliteyi korumak için plastik yüzeylere uçla temas etmekten kaçının. Dokunmatik ekranda Başlat'a basın.
- Tamamlandıktan sonra, ekran başarılı bir darbe gösterecektir. Pipeti cihazdan çıkarın ve hücreleri etiketli, kaplanmamış 12 oyuklu plakanın kuru bir kuyucuğuna yerleştirin.
- 15 mL PBS + Ca/Mg içinde iki kez yukarı ve aşağı pipetleyerek ucu durulayın. Pipeti, ucu takılıyken bir kenara koyun. Ucun hiçbir şeye temas etmediğinden ve steril kaldığından emin olun.
NOT: Birçok deneyde, aktif olmayan negatif kontrol sgRNA örneğinden sonra veya gen başına dört ila beş sgRNA test edildiğinde kılavuz aktivitesinin ilk değerlendirmeleri sırasında olduğu gibi ucu birden fazla örnek için yeniden kullanmak mümkündür. Bununla birlikte, düzenlenmiş hücreler üzerinde fonksiyonel analiz sırasında, az miktarda sgRNA veya hücre taşınması deneysel sonuçları etkileyebileceğinden, her gen için yeni bir uç önerilir. - Hemen hücrelere 1 mL antibiyotik içermeyen ortam (adım 3.6'da alıntılanmıştır) ekleyin ve karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın.
- Kalan reaksiyonlar için 5.2-5.6 adımlarını tekrarlayın.
- Hücreleri inkübatöre geri koyun.
- Elektroporasyondan 1-2 saat sonra hücrelerin canlılığını kontrol edin. Hücreler %>90 yapışık olmalıdır. İsteğe bağlı: Elektroporasyondan 1-2 saat sonra hücrelere gentamisin (5 μg/mL) ekleyin, eğer bu aşağı akış deneylerine müdahale etmeyecekse, kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur.
6. Düzenleme verimliliğinin değerlendirilmesi
NOT: Çoğu düzenleme 48 saat sonra tamamlanır.
- Elektroporasyondan 48 saat sonra hücre tek tabakasını kontrol edin. Hücreler% 50'nin üzerinde birleşikse, daha fazla ilerleyin. Hücreler% <50 birleşikse, 1-2 gün daha bekleyin. Düzenleme verimliliğini belirlemek için genomik DNA analizi, aşağı akış deneyi için gerekli hücrelere ek olarak 1 x 105 hücre gerektirir.
- Genomik DNA'yı (gDNA) hazırlayın.
- Hücreleri PBS (-Ca / Mg) ile yıkayın. 1 mL PBS + 1 mM EDTA ekleyin. Hücreler plakadan ayrılmaya başlayana kadar oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika inkübe edin.
- Pipetleme ile hücreleri ayırın. Düşük protein bağlayıcı bir mikrofüj tüpüne aktarın.
- Hücreleri sayın ve 1 x 105 hücreden oluşan bir alikotu çıkarın. Kalan hücreler, daha sonraki deneylerde kullanılmak üzere yeniden kaplanabilir. Genel olarak, deneyler, proteinin bozulmasına izin vermek için elektroporasyondan 5 gün sonra yapılır.
- Bir mikrofüj tüpünde maksimum hızda 15 saniye boyunca gDNA analizi için hücreleri peletleyin.
- Peletin 50 μL lizis tamponunda yeniden süspanse edilmesi. Tüpün duvarlarına yapışmış hücreleri ayırmak için vorteks yapın ve hücreleri parçalamak ve endojen DNazı etkisiz hale getirmek için 98 ° C'de 10 dakika ısıtın.
- Tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
- 1 μL proteinaz K (20 mg/mL) ekleyin. 37 °C'de en az 1 saat inkübe edin; Kolaylık sağlamak için bir gecede bırakılabilir.
- Proteinaz K'yi etkisiz hale getirmek için 10 dakika boyunca 98 ° C'ye ısıtın.
- Oda sıcaklığında maksimum hızda 5 dakika santrifüjleyin. DNA'yı içeren süpernatanı çıkarın. Daha fazla saflaştırma gerektirmeyen bu ham preparat, çoğu PCR reaksiyonu için iyi sonuç verir.
- Sanger dizilimi ile düzenleme verimliliğini değerlendirin.
- En 5' kılavuz sahalarının yukarı akışında 200-300 bp ve en fazla 3' kılavuz sahalarının akış aşağısında 200-300 bp PCR primerleri tasarlayın. Tipik amplikon boyutu ~ 500 bp'dir. En yakın kılavuz bölgesinden en az 125 bp uzakta iç içe geçmiş bir sıralama astarı tasarlayın (Şekil 2A).
- 2 μL gDNA kullanarak PCR gerçekleştirin.
- PCR ürününü dizileme için hazırlayın. Bu protokol bir eksonükleaz I/karides alkalin fosfataz (ExoI/SAP) tedavisi kullanır. Ticari DNA saflaştırma kitleri de işe yarar ancak daha fazla uygulama süresi gerektirir.
- 15 μL PCR ürünü hazırlayın. Sanger dizilimine müdahale eden dNTP'leri ve primerleri bozmak için 7.5 μL su, 1 μL 10x ExoI tamponu, 10 U ExoI ve 1 U SAP ekleyin.
- Enzimleri etkisiz hale getirmek için 37 °C'de 30 dakika, ardından 85 °C'de 20 dakika inkübe edin.
- Exo/SAP ile işlenmiş PCR ürününde Sanger dizilimi gerçekleştirin; numunede bulunan PCR ürününün boyutunu tahmin etmek için bilinen miktarda DNA boyutu işaretleyicisi kullanın. TIDE yazılımı, düzenleme verimliliğini doğru bir şekilde tahmin etmek için yüksek kaliteli dizi kromatogramlarına ihtiyaç duyduğundan, sıralama reaksiyonları optimizasyon gerektirebilir. Düzenlenmemiş lokus için dizi kromatogramı, minimum arka plana sahip net pikler sağlamalıdır (Şekil 2B, C).
- Düzenleme verimliliğini tahmin etmek için, düzenlenmiş gDNA'yı ve düzenlenmemiş kontrol gDNA'sını kullanarak Sanger dizileme kromatogram dosyalarını analiz etmek için TIDE'yi kullanın. (Tablo 1, Şekil 2). Sanger sıralama dosyalarını yükleyin ve yazılımı varsayılan ayarlarla çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVT şablonu 127 bp'lik bir PCR ürünüdür (Şekil 1B). Tam uzunlukta IVT ürünü, 70 bp çift sarmallı DNA fragmanına benzer şekilde göç eden 98 nt'lik bir RNA'dır (Şekil 1C).
Elektroporasyondan sonra, hücreler %>90 canlı olmalı ve toplam hücre sayısı başlangıç hücre sayısının %>70'i olmalıdır. Ortaya çıkan mutant hücre havuzu, Cas9 bölünme bölgesinin yakınından başlayarak çeşitli bir indel setine sahip olmalıdır. Hedeflenen genlerin PCR ve Sanger dizilimi ile analizi, Cas9 bölünme bölgesinin akış aşağısındaki her pozisyonda çoklu nükleotid göstermelidir (Şekil 2).
Şekil 1: sgRNA-Cas9 düzenleme sürecine genel bakış. (A) Kılavuz tasarımı, sgRNA üretimi ve Cas9-sgRNA dağıtımı için şematik. (B) Src sgRNA'ları 1, 2 ve 3 için IVT'den elde edilen PCR ürünü, %2'lik bir agaroz jel üzerinde çözüldü. Ok, doğru 127 bp PCR ürünlerini gösterir. (C) Src sgRNA'ları 1, 2 ve 3 için IVT'yi takip eden RNA ürünleri,% 2'lik bir agaroz jel üzerinde çözüldü. Parantezler doğru sgRNA ürünlerini gösterir. sgRNA'nın değişken göçü, RNA'nın ikincil yapısından kaynaklanmaktadır. Bu rakam ilk yazarın yüksek lisans tezinden16 yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Birden fazla hedeflenen gen için elde edilen yüksek düzenleme verimliliği. (A) PCR ve Sanger dizileme primerlerinin şeması. (B) TIDE'nin düzenleme verimliliğini değerlendirmesi için iş akışının şeması. (C) Hedeflemeyen bir kontrol sgRNA-Cas9 RNP (üstte) ve ROSA26'ya özgü sgRNA (altta) ile elektroporasyonlu BMDM'lerden ROSA26 lokusunun temsili Sanger dizileme kromatogramı; Cas9 bölünme bölgesi vurgulanır. Hesaplanan düzenleme verimliliği ve belirtilen indel sayısını barındıran dizilerin yüzdesi ile TIDE çıktısı (sağda). (D,E) Düzenlenmiş BMDM'lerde (D) Src ve Cblb genlerinin Sanger dizileme kromatogramları. Bu rakam ilk yazarın yüksek lisans tezinden16 yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ticari elektroporasyon arttırıcı nedeniyle düzenleme verimliliğinde orta düzeyde artış. BMDM'ler, ticari bir düzenleme geliştiricinin etkisini değerlendirmek için düşük verimli kılavuzlarla elektroporasyona tabi tutuldu. Elektroporasyondan önce, monte edilmiş RNP'lere 4 μM'lik bir nihai konsantrasyona 1 μL arttırıcı ilave edildi. Belirtilen Src sgRNA'nın düzenleme etkinliği TIDE kullanılarak değerlendirildi. Bu rakam ilk yazarın yüksek lisans tezinden16 yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Araç Adı | URL | ||
| Synthego - CRISPR Tasarım Aracı | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| Geniş Enstitü - CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| Indellerin Ayrışma Yoluyla İzlenmesi (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Tablo 1: Çevrimiçi araçların URL'leri.
| Astar Adı | Sıra | ||
| Kılavuza Özel Astar | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| Kılavuza Özel Astar - Cbl-b Kılavuz 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| Kılavuza Özel Astar - Cbl-b Kılavuz 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATATAgttttagagctagaa | ||
| Kılavuza Özel Astar - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGATgttttagagctagaa | ||
| Kılavuza Özel Astar - Scramble | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| Kılavuza Özel Astar - Src Guide 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| Kılavuza Özel Astar - Src Guide 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| Kılavuza Özel Astar - Src Guide 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 Ters Uzun Üniversal Astar | aaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctctaaaac | ||
| Üniversal İleri Amplifikasyon Astarı | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| Üniversal Ters Amplifikasyon Astarı | aaaaaagcaccgactcgg | ||
Tablo 2: sgRNA'nın IVT'si için şablon oluşturmak üzere PCR'de kullanılan oligonükleotidler. Gene özgü primerler için 20 nükleotid hedef dizisi büyük harfle yazılır.
| BMDM Büyüme ortamı. 4 ° C'de saklayın. | |||
| DMEM (DMEM) | |||
| Fetal sığır serumu | 0.1 | ||
| L-glutamin | 0,2 milyon | ||
| 3T3-MCSF Hücrelerinden MCSF süpernatanı** | 0.1 | ||
| Sodyum piruvat | 11 mg / mL | ||
| Lizis Tamponu. 4 ° C'de saklayın. | |||
| 2-merkaptoetanol (kullanımdan hemen önce ekleyin) | 0.01 | ||
| MgCl2 | 5 milyon | ||
| Tris | 20 milyon | ||
| Triton-X 100 Serisi | 0.005 | ||
| ** 3T3-MCSF hücreleri DMEM +% 10 FCS'de büyütülür. MCSF'li süpernadent,% 100 birleşmeye ulaştıktan sonra 5. günde hasat edilir. Alternatif olarak, şartlandırılmış ortam yerine 10ng / ml rekombinant MCSF kullanılabilir | |||
Tablo 3: Ortam ve tamponların bileşimleri.
Ek Dosya 1: ROSA_ Mock için ham sıralama dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: ROSA_TargettingGuide için ham dizileme dosyası Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 3: ScrambleGuide için ham sıralama dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 4: SrcG5+SrcG6 için ham sıralama dosyası Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 5: CBLB_Mock için ham sıralama dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 6: CBLB_TargetingGuide için ham sıralama dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 7: Mock_Guide2Locus için ham sıralama dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 8: Mock_Guide6Locus için ham sıralama dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 9: SrcGuide2_Enhancer için ham sıralama dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 10: SrcGuide2_NoEnhance için ham sıralama dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 11: SrcGuide6_Enhancer için ham sıralama dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 12: SrcGuide6_NoEnhancer için ham sıralama dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektroporasyonlu Cas9-sgRNA kompleksleri kullanılarak genom düzenleme, BMDM'lerde gen fonksiyonunun etkili bir şekilde bozulmasına izin verir. Düzenleme verimliliği, hedef diziye ve gene göre değişir. Tipik olarak, dört ila beş sgRNA, oldukça aktif olanı belirlemek için genellikle taranır. Bazı lokuslar, büyük olasılıkla kromatin yapısı nedeniyle daha düşük düzenleme verimliliğine sahiptir. Bu durumlarda, düzenleme verimliliğini artırmak için çeşitli değişiklikler yapılabilir. İki aktif sgRNA'nın aynı eksona birlikte verilmesi, bazı genler için gelişmiş düzenleme ile sonuçlanır. Bununla birlikte, iki kılavuz birlikte transfekte edildiğinde, TIDE'nin doğruluğunu kaybedebileceğini gözlemledik. Bu nedenle, Batı lekeleme gibi düzenlemeyi değerlendirmek için alternatif teknikler gerekebilir. Ek olarak, ticari olarak temin edilebilen bir NHEJ geliştiricinin dahil edilmesi, düzenleme verimliliğini genellikle ~% 20 oranında artırır (Şekil 3).
Bu yaklaşımın çeşitli avantajları vardır. sgRNA-Cas9'un hücrelere doğrudan verilmesi, BMDM'leri dönüştürmek için plazmit yapımının veya lentiviral vektör üretiminin zaman alıcı adımlarını gerektirmez. SgRNA'nın sentezlenmesi, elektroporasyon ve mutant hücrelerin üretilmesi süreci 1 haftada tamamlanabilir. Bu teknik, çift mutant hücreler oluşturmak için genetiği değiştirilmiş farelerden türetilen BMDM'lerle de kullanılabilir. Birincil bağışıklık hücrelerini siRNA veya mRNA17 ile transfekte etmek için kimyasal yöntemler mevcut olsa da, bu kimyasal yöntemler, bağışıklık hücrelerine Cas9-sgRNA kompleksleri iletmede elektroporasyondan önemli ölçüde daha az etkilidir18. Ticari olarak temin edilebilen çeşitli elektroporasyon cihazları vardır. Bu cihazların Cas9-sgRNA komplekslerinin iletimi için benzer şekilde çalışması beklenmektedir, ancak voltaj parametrelerinin her bir cihaz için optimize edilmesi gerekebilir. Bu protokol öncelikle fare BMDM'lerinde kullanılmış olsa da, sınırlı deneylerde sıçan BMDM'leri (yayınlanmamış veriler) ile benzer sonuçlar elde edilmiştir. Fare peritoneal makrofajları veya alveolar makrofajlar gibi diğer primer makrofaj türlerinin de bu yaklaşıma uygun olması mümkündür, ancak bu henüz test edilmemiştir.
Bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır. Bu protokol tarafından üretilen hücre sayısı biraz sınırlıdır; Standart koşullarımız elektroporasyon başına 4 x 105 hücre üretir. Bununla birlikte, aynı miktarda RNP (yayınlanmamış veriler) kullanılarak 2.4 x 106 hücreye kadar 10 μL'lik bir reaksiyonda verimlilik azalmadığından, verimi önemli ölçüde artırmak mümkün olabilir. Ek olarak, 100 μL elektroporasyon uçları mevcuttur. Bu yöntemin bir diğer dezavantajı masraftır; Hem elektroporatör hem de elektroporasyon sarf malzemelerinin maliyetleri oldukça yüksektir. Bu masraflar, aynı geni hedefleyen farklı sgRNA'lar kullanılırken uçların yeniden kullanılmasıyla ve tescilli tamponlar yerine PBS kullanılarak önemli ölçüde azaltılabilir. Tescilli tamponların bileşimleri bilinmemekle birlikte, muhtemelen PBS'nin 0.9 mM CaCl2 ve 0.5 mM MgCl2 ile elektrolit bileşimi, tescilli tamponun elektriksel iletkenliğine yaklaşır. Bu değişiklikler, bu protokolde sarf malzemelerinin maliyetini yaklaşık %80 oranında azaltır.
Protokolde, gen düzenlemesinin verimliliğini önemli ölçüde etkileyebilecek sapmalar olan birkaç kritik adım vardır. Potansiyel tuzaklardan biri, yüksek verim için tasarlanmamış standart IVT kitlerinin genellikle yetersiz IVT ürünü üretmesidir. Ek olarak, düşük bağlayıcı tüpler yerine standart polipropilen mikrofüj tüplerinin kullanılması, yapışma yoluyla önemli hücre kaybına neden olabilir. IVT ürününün eksik fosforilasyonu ve sgRNA preparatında kalıntı DNA'nın varlığı, makrofaj bağışıklık sensörlerinin aktivasyonuna ve ardından toksisiteye neden olabilir. Daha yüksek veya daha uzun voltaj darbeleri de hücre ölümünün artmasına neden olabilir.
Özetle, Cas9-sgRNA RNP'leri iletmek için elektroporasyon kullanan bu genom düzenleme protokolü, fare BMDM'lerindeki genleri bozmak için etkili bir yöntemdir. Bu, kullanıcıların, makrofajların karmaşık biyolojisini in vivo olarak daha yakından özetleyen birincil hücrelerdeki fenotipleri hızlı bir şekilde taramasına olanak tanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibesi 5R01AI144149 tarafından finanse edilmiştir. Şematik şekiller BioRender ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , Master's thesis (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
