Summary
이 프로토콜은 시험관내에서 조립되고 전기천공법으로 전달되는 Cas9-sgRNA 리보핵단백질 복합체를 사용하여 마우스 골수 유래 대식세포에서 게놈 편집 절차를 설명합니다.
Abstract
생쥐의 골수 유래 대식세포(BMDM)는 조직 대식세포의 복잡한 생물학을 연구하기 위한 핵심 도구입니다. 일차 세포로서 생체 내 대식세포의 생리학을 불멸화된 대식세포 세포주보다 더 밀접하게 모델링하며 이미 정의된 유전적 변화를 가지고 있는 마우스에서 파생될 수 있습니다. 그러나 BMDM에서 유전자 기능을 방해하는 것은 기술적으로 여전히 어려운 과제입니다. 여기서는 BMDM에서 효율적인 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 프로토콜을 제공하며, 이를 통해 유전자 기능을 방해하는 프레임시프트 돌연변이를 초래하는 작은 삽입 및 결실(indel)을 도입할 수 있습니다. 이 프로토콜은 단일 가이드 RNA(sgRNA-Cas9)를 합성하고 전기천공법으로 전달할 수 있는 정제된 sgRNA-Cas9 리보핵단백질 복합체(RNP)를 형성하는 방법을 설명합니다. 또한 일상적인 Sanger 염기서열분석과 무료로 제공되는 온라인 분석 프로그램을 사용하여 편집 효율성을 모니터링하는 효율적인 방법을 제공합니다. 프로토콜은 1주일 이내에 수행할 수 있으며 플라스미드 구축이 필요하지 않습니다. 일반적으로 85%에서 95%의 편집 효율성을 얻을 수 있습니다.
Introduction
대식세포는 조직 복구와 면역에 중요한 역할을 하는 선천성 면역 세포입니다 1,2. 마우스 RAW 264.7 세포 또는 인간 THP-1 세포와 같은 불멸화된 대식세포 세포주는 RNA 간섭 또는 CRISPR/Cas9 3,4에 대한 벡터를 전달하여 강력한 성장과 유전자 파괴 용이성을 포함하여 여러 가지 유익한 특성을 가지고 있습니다. 그러나 종양 변형은 생리학을 극적으로 변화시켜 일부 경로의 비정상적인 활성화와 다른 경로의 음소거 반응을 초래합니다 5,6. 일차 골수 유래 대식세포(BMDM)는 생체 내 대식세포 생리학을 보다 밀접하게 재현하지만, 이러한 일차 면역 세포에서 플라스미드 형질주입 및 바이러스 형질주입의 효율성이 낮기 때문에 유전적으로 조작하는 것이 여전히 어렵습니다 7,8. 따라서 유전자 기능을 교란하기 위한 보다 효율적인 방법이 필요하다.
CRISPR/Cas9 게놈 편집은 포유류 세포 9,10,11,12를 포함한 다양한 생물학적 시스템에서 유전자 조작을 위한 강력한 도구입니다. Streptococcus pyogenes Cas9 단백질은 염기서열 특이적 가이드 RNA와 복합체될 때 이중 가닥 DNA를 효율적이고 특이적으로 절단합니다. 절단된 DNA의 NHEJ(non-homologous end joining)를 통한 DNA 복구는 프레임시프트 돌연변이를 생성하는 작은 삽입 또는 결실(indels)을 초래합니다. 초기 연구에서 Cas9 및 sgRNA는 플라스미드 또는 렌티바이러스 벡터를 통해 전달되었으며, 이는 많은 세포주에 대한 효과적인 전달 방법입니다 9,10. 그러나, 일차 세포, 특히 일차 면역 세포는 형질주입 또는 형질도입에 의한 벡터 전달의 효율이 낮기 때문에 종종 이러한 방법에 불응한다. 그 후, 시험관 내에서 sgRNA-Cas9 복합체를 생성하고 전기천공법을 통해 전달하는 방법이 개발되었으며, 이러한 방법은 다양한 세포 유형에서 높은 효율을 달성했습니다13,14. 결과는 1차 대식세포에서 게놈 편집을 수행하기 위해 이 접근법을 사용할 가능성을 시사했습니다.
여기서는 sgRNA-Cas9 리보핵단백질 복합체(RNP)를 사용하여 1차 BMDM에서 게놈 편집을 수행하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 여기에는 일차 면역 세포에 존재하는 면역 센서의 활성화를 완화하는 단계가 포함되어 있으며 최소한의 독성으로 표적 유전자좌에서 최대 95%까지 편집됩니다. 이 프로토콜에는 일상적인 중합효소연쇄반응(PCR) 및 Sanger 염기서열분석을 사용하여 편집 효율성을 평가하는 워크플로우와 검증된 온라인 소프트웨어 도구인 TIDE(Tracking of Indels by Decomposition)15를 통한 인실리코(in silico) 분석도 포함됩니다.
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Protocol
1. sgRNA 디자인
NOTE: 이 단계에서는 sgRNA의 표적 염기서열 선택 및 설계에 대해 설명합니다. 첫 번째 큰 코딩 엑손(big coding exon)에 있는 가이드를 설계하여 번역된 단백질이 열린 판독 프레임 초기에 파괴되도록 하는 것이 도움이 됩니다. 또한 동일한 엑손 내에 있는 표적 염기서열을 선택하는 것이 도움이 되는데, 이는 편집 효율 분석을 간소화하기 때문입니다(6단계). 이 프로토콜과 함께 제공되는 게놈 편집의 예는 Src 유전자 및 Cblb 유전자의 첫 번째 엑손뿐만 아니라 마우스 게놈의 비암호화 Rosa26 유전자좌를 표적으로 하는 sgRNA를 사용했습니다.
- 여러 무료 온라인 설계 도구 중 하나를 사용하여 표적화할 20개의 뉴클레오티드 게놈 염기서열을 식별합니다(표 1). Cas9 활성은 선택한 특정 가이드에 따라 다르기 때문에 각 유전자 내에서 겹치지 않는 4-5개의 가이드를 선택하고 고도로 활성 가이드의 선험적 예측이 불가능합니다.
알림: 표적 궤적의 순서를 기준으로 가이드의 적절한 방향을 확인하는 것이 중요합니다. 설계 도구는 일반적으로 어떤 염색체 가닥이 표적이 되는지에 관계없이 5'에서 3' 방향의 가이드 시퀀스를 제공합니다. 가닥 배향을 확인하려면 표적 게놈 염기서열의 3' 즉시 S. pyogenes Cas9(nGG)에 대한 protospacer adjacent motif(PAM) 서열이 있는지 확인합니다. sgRNA 염기서열은 PAM을 포함하지 않습니다.
2. sgRNA 합성
참고: 이 단계에서는 PCR을 사용하여 sgRNA를 합성하여 IVT(in vitro transcription)를 위한 템플릿을 생성한 다음 스핀 컬럼을 사용하여 sgRNA를 정제하는 방법을 설명합니다(그림 1A). 맞춤형 합성 sgRNA는 PCR/IVT의 대안으로 여러 공급업체를 통해 상업적으로 이용 가능합니다.
- PCR을 수행하여 T7 RNA 중합효소에 대한 IVT 템플릿을 생성합니다. PCR 반응은 유전자 특이적 가이드 서열이 있는 짧은 개별 프라이머 외에도 T7 RNA 중합효소 프로모터와 trans-activating CRISPR RNA(tracrRNA) 서열(표 2)을 포함하는 범용 프라이머를 사용합니다.
- 이는 비증폭 중첩 확장 단계입니다. PCR 완충액을 1배로 희석하고 1mMMgCl2를 추가합니다. 그런 다음 0.25μL의 고충실도 DNA 중합효소, 0.5mM 디옥시뉴클레오티드 삼인산(dNTP), 0.02mM 가이드 특이적 프라이머 및 0.02mM T7 역긴 범용 프라이머(표 2)를 총 46μL의 부피에 추가합니다. 그런 다음 튜브를 열순환기에 놓고 95°C에서 15초, 37°C에서 15초, 72°C에서 15초를 두 번 실행합니다. 얼음 위에서 반응을 식히십시오.
- PCR 증폭 단계입니다. 각 반응에 25mM 순방향 증폭 프라이머 2μL와 25mM 역증폭 프라이머 2μL를 추가합니다. 최종 반응 부피는 50μL입니다. 95°C에서 30초 동안 변성. 그런 다음 95°C에서 15초, 65°C에서 20초, 72°C에서 15초를 35회 실행합니다. 72°C에서 2분 동안 추가 확장을 수행합니다.
- 2% 아가로스 겔에서 PCR 반응 생성물을 확인합니다. 중첩 확장 PCR은 유전자 특이적 20 뉴클레오티드 가이드의 업스트림에 T7 프로모터가 있고 바로 다운스트림에 있는 tracrRNA가 있는 127bp dsDNA 분자를 생성합니다(그림 1B).
- IVT 템플릿 정제: 이를 위해 잘 작동하는 수많은 프로토콜과 키트가 있습니다. 이 프로토콜은 SPRI(Solid-Phase Reversible Immobilization) 비드를 사용합니다. PCR 산물 50μL를 90μL의 비드와 혼합하고 제조업체의 지침을 따릅니다. 40μL의 완충액(5mM Tris, 0.1mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA])을 첨가하고 65°C에서 5분 동안 가열하여 DNA를 용출합니다.
- 260nm의 파장에서 흡수를 사용하여 IVT 템플릿의 DNA 농도를 측정합니다. IVT에는 최소 50ng/μL의 DNA 농도가 필요합니다. IVT 템플릿은 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
- IVT 반응
- 높은 수율의 IVT를 생산하도록 설계된 상용 키트를 사용하십시오( 재료 표 참조). 제조업체의 권장 사항에 따라 IVT 반응을 수행합니다. 20 μL 반응에서 250 ng의 IVT 템플릿을 사용하여 37 °C에서 4-16 시간 동안 배양합니다.
- 2% 아가로스 겔에 1μL의 반응을 실행하여 IVT sgRNA 산물을 확인합니다. 70bp dsDNA와 유사하게 작동하는 밝은 RNA 밴드를 관찰해야 합니다(그림 1C). 필수는 아니지만 선명하고 더 분해능이 높은 띠를 얻으려면 요소와 함께 RNA 샘플 버퍼를 사용하고 로딩 전에 샘플을 65°C에서 5분 동안 변성시킵니다.
참고: RNA 2차 구조의 차이로 인해 일부 가이드 RNA에서 희미한 고분자량 밴드와 약간의 이동 차이가 나타날 수 있습니다.
- sgRNA IVT 산물을 탈인산화하여 RIG-I(외부 RNA 센서)의 활성화와 전기천공법 후 후속 세포 사멸을 최소화합니다. 각 20μL IVT 반응에 대해 1x CIP 완충액에 분자 등급 물 69μL와 송아지 장 인산가수분해효소(CIP) 15U를 추가합니다. 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.
- IVT 템플릿을 분해하여 전기천공법 후 세포 사멸을 유발하는 세포 DNA 센서의 활성화를 최소화합니다. 각 IVT 반응에 2U의 RNase-free DNase를 추가합니다. 37°C에서 15분간 배양합니다. IVT 제품은 -20°C에서 1일 또는 -80°C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 스핀 컬럼을 사용하여 IVT 산물을 정제합니다. 이 단계의 경우 SPRI 비드 정제 키트가 열등합니다.
- IVT 산물에 220μL의 결합 완충액을 첨가한 후 100% 분자 생물학 등급 에탄올 1mL를 첨가하여 RNA를 컬럼에 결합합니다. 잘 섞고 컬럼을 로드합니다. 그런 다음 제조업체의 지침을 따르십시오. sgRNA의 오염을 방지하기 위해 층류 생물 안전 캐비닛에서 최종 세척을 수행합니다.
- 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 용출을 수행합니다. 30μL의 멸균 10mM Tris 완충액(pH 8.0)을 사용하여 RNA를 용출합니다.
- 260nm 파장에서 흡광도를 측정하여 sgRNA의 농도를 측정합니다.
참고: 일반적인 sgRNA 수율은 최소 100μg입니다. - sgRNA를 -80°C에서 보관합니다. 3회 이상의 동결-해동 주기를 피하기 위해 부분 표본을 만드십시오.
3. 전기천공법 준비
알림: 모든 단계는 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 수행해야 합니다. 이 프로토콜은 10μL 팁이 있는 상업적으로 이용 가능한 electroporation 시스템( 재료 표 참조)을 사용합니다.
- 사용하기 전에 BMDM을 48-72시간 해동하고 비조직 배양(TC) 처리된 플레이트에서 확장합니다.
참고: 반응당 4 x 105 세포가 필요합니다. - 반응 조립을 위해 PCR 튜브를 멸균합니다. 반응 당 하나의 PCR 튜브를 준비하고 98 °C에서 10 분 동안 thermocycler에서 가열합니다. 튜브를 일괄적으로 준비하고 밀봉하여 보관하십시오. 사용할 준비가 되면 멸균된 PCR 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 피펫 스테이션을 70% 에탄올로 세척하고 층류 후드에 넣습니다. 파라미터를 1,900V, 20ms 및 1펄스로 설정합니다.
- transfection 튜브를 멸균 상태로 유지하기 위해 조심스럽게 포장에서 제거하고 3mL의 "E" 완충액을 채웁니다. 전기 천공법 전에 E 버퍼가 실온에 있는지 확인하십시오. 스테이션에 튜브를 삽입하고 딸깍 소리가 날 때까지 아래로 누릅니다.
- 각 반응에 대해 1,100ng/μL 농도로 sgRNA 2.5μL를 분취합니다. sgRNA를 0.9mMCaCl2 및 0.5mM MgCl2( PBS + Ca/Mg)로 저온 인산염 완충 식염수(PBS)에 희석합니다. 얼음 위에 두십시오.
- 두 개의 플레이트를 준비합니다: 세포를 위한 12웰 비코팅 플레이트와 배양 배지를 담기 위한 추가 24웰 플레이트. 반응당 1.5mL의 무항생제 배지를 24웰 플레이트의 웰에 분취합니다.
- Cas9 단백질을 준비합니다. 멸균 정제된 Cas9 단백질의 여러 상업 및 학술 공급업체가 있습니다. Cas9를 차가운 PBS + Ca/Mg으로 최종 농도 20μM로 희석합니다. 각 electroporation 반응에 대해 20μM Cas9 1μL를 멸균 PCR 튜브에 분취합니다. 얼음 위에 두십시오.
- 전기천공법을 위해 세포를 준비합니다.
- 성장 배지를 제거하십시오. CaCl2 및 MgCl2 (PBS-Ca/Mg)가 없는 PBS를 사용하여 세포를 세척하여 접착을 촉진하는 혈청 및 2가 양이온을 제거합니다. 그런 다음 PBS + 1mM EDTA를 추가하고 세포가 분리되기 시작할 때까지 실온에서 약 5분 동안 배양합니다.
- 피펫을 위아래로 부드럽게 움직여 세포를 분리합니다. 세포를 단백질 결합이 적은 15mL 튜브로 옮깁니다. 세포를 500 x g 에서 5분 동안 펠렛합니다.
알림: 대식세포는 플라스틱 용기에 부착됩니다. 단백질 결합이 적은 원심분리기 튜브를 사용하면 세포 수율이 크게 향상됩니다. - PBS + EDTA에서 세포의 장기간 배양을 피하기 위해 신속하게 작업하십시오. 튜브에 약 1mL의 상층액을 남기고 대부분의 상층액을 제거합니다. 나머지 상층액에 세포를 재현탁시킨 다음 단백질 결합이 적은 1.5ml 미세분리 튜브로 옮깁니다.
- 셀 세포의 작은 부분 표본을 제거합니다. 실온에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 나머지 세포를 펠트합니다.
- 원심분리하는 동안 세포를 계수하고 Cas9 및 sgRNA 튜브를 실온으로 예열합니다.
- 세포 펠릿에서 모든 상층액을 제거합니다. 4 x 107 cells/mL(10 μL 반응당 4 x 105 세포)의 농도에서 PBS + Ca/Mg의 세포를 재현탁시킵니다.
참고: 각 키트에는 제한된 양의 electroporation 버퍼(버퍼 R, 버퍼 T)가 제공됩니다. 그러나 PBS + Ca/Mg를 사용한 전기천공법 효율은 독점 완충액과 동일하다는 것을 알 수 있습니다. - 서로 다른 유전자에 대해 sgRNA를 전기포칭할 때 sgRNA 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 유전자에 대해 세포를 서로 다른 저단백질 결합 튜브로 분주합니다. electroporation를 위해 준비될 때까지 세포를 실내 온도에 두십시오.
4. RNP 집합
- sgRNA와 Cas9은 침전을 피하기 위해 실온에 보관하십시오. 멸균된 PCR 튜브에서 희석된 Cas9 1μL에 2.5μL의 sgRNA를 추가합니다. 침전을 방지하기 위해 혼합하여 sgRNA를 15초 이상 천천히 분배합니다.
- RNP 복합체 형성을 위해 실온에서 5분 동안 배양합니다.
5. electroporation에 의하여 RNP 납품
- electroporation 팁(큐벳)을 준비합니다. 플런저를 눌러 스템을 확장합니다. 줄기를 팁에 삽입합니다.
알림: 팁이 고정되어 있고 플런저가 부드럽게 미끄러지고 팁 덮개를 넘어 확장되는지 확인하십시오. 팁의 위치가 올바르지 않으면 팁에 기포가 유입되어 팁이 파손될 수 있습니다. - 위아래로 피펫팅하여 셀을 재현탁한 다음 electroporation 팁에 셀을 로드합니다. 팁의 전체 10μL 부피 용량을 빼내어 기포를 방지합니다.
- negative control sgRNA부터 시작하여 4단계에서 electroporation 팁에 있는 10μL의 세포를 3.5μL의 RNP가 포함된 샘플 튜브로 옮깁니다. 잘 섞이도록 피펫을 위아래로 세 번 반복합니다. 혼합물 10μL를 팁에 다시 끌어당겨 기포가 없는지 확인합니다.
- 팁을 전기천공법 스테이션에 놓고 버퍼로 내립니다. 멸균 상태를 유지하기 위해 플라스틱 표면과 팁을 접촉하지 마십시오. 터치스크린 디스플레이에서 Start(시작 )를 누릅니다.
- 완료 후 디스플레이에 성공적인 펄스가 표시됩니다. 장치에서 피펫을 제거하고 라벨이 부착된 코팅되지 않은 12웰 플레이트의 드라이 웰에 세포를 넣습니다.
- 15mL의 PBS + Ca/Mg을 위아래로 두 번 피펫팅하여 팁을 헹굽니다. 팁이 부착된 상태로 피펫을 따로 보관합니다. 팁이 아무 것도 닿지 않고 멸균 상태를 유지하는지 확인하십시오.
참고: 많은 실험에서 비활성 음성 대조군 sgRNA 샘플 후 또는 유전자당 4-5개의 sgRNA를 테스트하고 유일한 판독이 편집 효율성인 가이드 활성의 초기 평가 중과 같이 여러 샘플에 대해 팁을 재사용할 수 있습니다. 그러나 편집된 세포에 대한 기능 분석 중에는 소량의 sgRNA 또는 세포 캐리오버가 실험 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 각 유전자에 대해 새로운 팁을 사용하는 것이 좋습니다. - 즉시 1mL의 무항생제 배지(3.6단계에서 분주)를 세포에 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합합니다.
- 나머지 반응에 대해 5.2-5.6단계를 반복합니다.
- 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.
- electroporation 후 1-2 시간 동안 세포의 생존력을 확인하십시오. 세포는 >90% 부착되어야 합니다. 선택 사항: 전기천공법 후 1-2시간 후에 세포에 겐타마이신(5μg/mL)을 추가하면 다운스트림 실험을 방해하지 않는 경우 오염을 방지하는 데 도움이 됩니다.
6. 편집 효율성 평가
참고: 대부분의 편집은 48시간 후에 완료됩니다.
- electroporation 48 시간 후에 세포 단층을 검사하십시오. 세포가 50% 이상 합류하면 계속 진행합니다. 세포가 <50% 합류하면 1-2일 더 기다립니다. 편집 효율을 결정하기 위한 게놈 DNA 분석에는 다운스트림 실험에 필요한 세포 외에도 1 x 105 세포가 필요합니다.
- 게놈 DNA(gDNA)를 준비합니다.
- PBS(-Ca/Mg)로 세포를 세척합니다. 1mL의 PBS + 1mM EDTA를 추가합니다. 세포가 플레이트에서 분리되기 시작할 때까지 실온에서 약 5분 동안 배양합니다.
- 피펫팅을 통해 세포를 분리합니다. 단백질 결합이 적은 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다.
- 세포를 세고 1 x 105 세포의 부분 표본을 제거합니다. 나머지 셀은 추가 실험에 사용하기 위해 다시 도금할 수 있습니다. 일반적으로, 실험은 electroporation 후에 단백질의 붕괴를 허용하기 위하여 5 일 실행된다.
- gDNA 분석을 위해 세포를 미세분리 튜브에서 최대 속도로 15초 동안 펠렛화합니다.
- 펠릿을 50μL의 용해 완충액에 재현탁시킵니다. 소용돌이를 일으켜 튜브 벽에 붙어있는 세포를 분리하고 98°C에서 10분 동안 가열하여 세포를 용해하고 내인성 DNase를 비활성화합니다.
- 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 1μL 단백질 분해효소 K(20mg/mL)를 추가합니다. 37 °C에서 최소 1 시간 동안 배양합니다. 편의를 위해 하룻밤 방치할 수 있습니다.
- 98°C에서 10분 동안 가열하여 단백질 분해효소 K를 비활성화합니다.
- 실온에서 최대 속도로 5분 동안 원심분리합니다. DNA가 들어 있는 상층액을 제거합니다. 추가 정제 없이 이 미처리 제제는 대부분의 PCR 반응에 적합합니다.
- Sanger 염기서열분석으로 편집 효율성을 평가합니다.
- 대부분의 5' 가이드 부위의 업스트림 200-300 bp 및 대부분의 3' 가이드 부위의 200-300 bp 다운스트림에서 PCR 프라이머를 설계합니다. 일반적인 앰플리콘 크기는 ~500bp입니다. 가장 가까운 가이드 부위에서 최소 125bp 떨어진 곳에 중첩 염기서열분석 프라이머를 설계합니다(그림 2A).
- 2μL의 gDNA를 사용하여 PCR을 수행합니다.
- 시퀀싱을 위해 PCR 산물을 준비합니다. 이 프로토콜은 엑소뉴클레아제 I/새우 알칼리성 인산가수분해효소(ExoI/SAP) 처리를 사용합니다. 상용 DNA 정제 키트도 작동하지만 더 많은 실습 시간이 필요합니다.
- PCR 산물 15μL를 준비합니다. 물 7.5μL, 10x ExoI 완충액 1μL, ExoI 10U, SAP 1U를 첨가하여 Sanger 염기서열분석을 방해하는 dNTP 및 프라이머를 분해합니다.
- 37°C에서 30분 동안 배양한 다음 85°C에서 20분 동안 배양하여 효소를 비활성화합니다.
- Exo/SAP 처리된 PCR 산물에 대해 Sanger 염기서열분석을 수행합니다. 샘플에 존재하는 PCR 산물의 크기를 추정하기 위해 알려진 양의 DNA 크기 마커를 사용합니다. 염기서열분석 반응은 TIDE 소프트웨어가 편집 효율을 정확하게 추정하기 위해 고품질 염기서열 크로마토그램이 필요하기 때문에 최적화가 필요할 수 있습니다. 편집되지 않은 유전자좌에 대한 염기서열 크로마토그램은 최소한의 백그라운드로 명확한 피크를 제공해야 합니다(그림 2B, C).
- 편집 효율을 추정하려면 TIDE를 사용하여 편집된 gDNA와 편집되지 않은 대조군 gDNA를 사용하여 Sanger 염기서열분석 크로마토그램 파일을 분석합니다. (표 1, 그림 2). Sanger 염기서열분석 파일을 업로드하고 기본 설정으로 소프트웨어를 실행합니다.
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Representative Results
IVT 템플릿은 127bp PCR 산물입니다(그림 1B). 전장 IVT 산물은 98 nt RNA로, 70 bp 이중 가닥 DNA 단편과 유사하게 이동합니다(그림 1C).
electroporation 후에, 세포는 시작 세포 수의 >70%의 총 세포 조사와 더불어 >90% 생존가능해야 합니다. 돌연변이 세포의 결과 풀은 Cas9 절단 부위 근처에서 시작하여 다양한 indels 세트를 가져야 합니다. PCR 및 Sanger 염기서열분석에 의한 표적 유전자 분석은 Cas9 절단 부위의 다운스트림 각 위치에서 여러 뉴클레오티드를 보여주어야 합니다(그림 2).
그림 1: sgRNA-Cas9 편집 공정 개요. (A) 가이드 설계, sgRNA 생성 및 Cas9-sgRNA 전달에 대한 개략도. (B) Src sgRNA 1, 2 및 3에 대한 IVT의 PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 분리되었습니다. 화살표는 올바른 127bp PCR 산물을 나타냅니다. (C) Src sgRNA 1, 2 및 3에 대한 IVT 후 RNA 산물은 2% 아가로스 겔에서 분리되었습니다. 괄호는 올바른 sgRNA 산물을 나타냅니다. sgRNA의 가변 이동은 RNA 2차 구조에 기인합니다. 이 그림은 제1저자의 석사학위논문16에서 전재한 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 여러 표적 유전자에 대해 달성된 높은 편집 효율. (A) PCR 및 Sanger 염기서열분석 프라이머의 개략도. (B) 편집 효율성을 평가하기 위한 TIDE의 워크플로 개략도. (C) 대조군 비표적 sgRNA-Cas9 RNP(위) 및 ROSA26 특이적 sgRNA(아래)로 전기천공된 BMDM에서 ROSA26 유전자좌의 대표적인 Sanger 염기서열분석 크로마토그램; Cas9 절단 부위가 강조 표시됩니다. TIDE 출력(오른쪽)과 계산된 편집 효율 및 표시된 인델 수를 포함하는 시퀀스의 백분율. (디,이) 편집된 BMDM에서 (D) Src 및 Cblb 유전자의 Sanger 염기서열분석 크로마토그램. 이 그림은 제1저자의 석사학위논문16에서 전재한 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 상용 electroporation enhancer로 인한 편집 효율의 중간 증가. BMDM은 상업용 편집 인핸서의 효과를 평가하기 위해 저효율 가이드로 전기 천공되었습니다. 전기천공법 이전에, 인핸서 1μL를 최종 농도 4μM까지 조립된 RNP에 첨가하였다. 지시된 Src sgRNA의 편집 효율은 TIDE를 사용하여 평가하였다. 이 그림은 제1저자의 석사학위논문16에서 전재한 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 도구 이름 | URL (영문) | ||
| Synthego - CRISPR 설계 도구 | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| 브로드 인스티튜트(The Broad Institute) - 크리스픽 | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| 분해에 의한 Indels 추적(TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
표 1: 온라인 도구의 URL.
| 프라이머 이름 | 순서 | ||
| 가이드별 입문서 | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| 가이드별 입문서 - Cbl-b Guide 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| 가이드별 입문서 - Cbl-b 가이드 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAAAAATATATAgttttagagctagaa | ||
| 가이드별 입문서 - Rosa | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGAGATGTTTTAGAGCTAGAA | ||
| 가이드별 입문서 - 스크램블 | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| 가이드별 입문서 - Src Guide 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGACGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| 가이드별 입문서 - Src Guide 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| 가이드별 입문서 - Src 가이드 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 리버스 롱 유니버셜 프라이머 | 아 | ||
| 범용 순방향 증폭 입문서 | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| 범용 역증폭 프라이머 | 아 | ||
표 2: sgRNA의 IVT에 대한 템플릿을 생성하기 위해 PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드. 유전자 특이적 프라이머에 대한 20개의 뉴클레오티드 표적 서열은 대문자화됩니다.
| BMDM 성장 매체. 4C에서 보관하십시오. | |||
| 디엠 | |||
| 소 태아 혈청 | 0.1 | ||
| L-글루타민 | 0.2 미터 | ||
| 3T3-MCSF 세포의 MCSF 상층액** | 0.1 | ||
| 피루브산나트륨 | 11mg/mL | ||
| 용해 버퍼. 4C에서 보관하십시오. | |||
| 2-메르캅토에탄올(사용 직전에 첨가) | 0.01 | ||
| 마그네슘화합물 2 | 5 mM | ||
| 트리스 | 20 밀리미터 | ||
| 트리톤-X 100 | 0.005 | ||
| **3T3-MCSF 세포는 DMEM+10% FCS에서 성장합니다. MCSF가 함유된 상층액은 100% 합류에 도달한 후 5일째 되는 날에 수확됩니다. 대안으로 10ng/ml 재조합 MCSF를 컨디셔닝된 배지 대신 사용할 수 있습니다. | |||
표 3: 미디어 및 버퍼의 구성.
보충 파일 1: Raw sequencing file for ROSA_ Mock 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: ROSA_TargettingGuide용 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: ScrambleGuide용 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: SrcG5+SrcG6에 대한 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5: CBLB_Mock용 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6: CBLB_TargetingGuide용 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 7: Mock_Guide2Locus용 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 8: Mock_Guide6Locus용 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 9: SrcGuide2_Enhancer용 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 10: SrcGuide2_NoEnhance용 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 11: SrcGuide6_Enhancer용 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 12: SrcGuide6_NoEnhancer용 원시 시퀀싱 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 게놈 편집은 BMDM에서 유전자 기능을 효과적으로 방해할 수 있습니다. 편집 효율은 표적 염기서열과 유전자에 따라 다릅니다. 일반적으로 4-5개의 sgRNA를 스크리닝하여 활성이 높은 sgRNA를 식별합니다. 일부 유전자좌는 편집 효율이 낮은데, 이는 염색질 구조 때문일 가능성이 큽니다. 이러한 경우 편집 효율성을 높이기 위해 몇 가지 수정을 수행할 수 있습니다. 두 개의 활성 sgRNA를 동일한 엑손에 함께 전달하면 일부 유전자의 편집이 개선됩니다. 그러나 두 개의 가이드가 함께 transfection되면 TIDE의 정확도가 떨어질 수 있습니다. 따라서 웨스턴 블로팅(Western blotting)과 같은 편집을 평가하기 위한 대체 기술이 필요할 수 있습니다. 또한 시판되는 NHEJ 인핸서를 포함하면 편집 효율이 ~20% 증가하는 경우가 많습니다(그림 3).
이 접근 방식에는 몇 가지 장점이 있습니다. sgRNA-Cas9을 세포에 직접 전달하기 위해서는 BMDM을 transduction하기 위해 플라스미드 구축이나 렌티바이러스 벡터 생산과 같은 시간이 많이 소요되는 단계가 필요하지 않습니다. sgRNA 합성, 전기천공법, 돌연변이세포 생성 과정은 1주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 기술은 이중 돌연변이 세포를 만들기 위해 유전자 변형 마우스에서 파생된 BMDM과 함께 사용할 수도 있습니다. siRNA 또는 mRNA17로 일차 면역 세포를 transfection하는 화학적 방법이 존재하지만, 이러한 화학적 방법은 Cas9-sgRNA 복합체를 면역 세포에 전달하는 데 전기천공법보다 훨씬 덜 효과적입니다18. 상업적으로 이용 가능한 여러 유형의 전기 천공법 장치가 있습니다. 이러한 장치는 Cas9-sgRNA 복합체의 전달을 위해 유사하게 작동할 것으로 예상되지만 전압 매개변수는 각 개별 장치에 대해 최적화되어야 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 주로 쥐 BMDM에 사용되었지만, 제한된 실험에서는 쥐 BMDM(미공개 데이터)에서도 유사한 결과를 얻었습니다. 쥐 복막 대식세포(mouse peritoneal macrophage) 또는 폐포 대식세포(alveolar macrophage)와 같은 다른 유형의 일차 대식세포(primary macrophage)도 이 접근법에 적합할 수 있지만, 아직 테스트되지는 않았습니다.
이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이 프로토콜에 의해 생성되는 셀의 수는 다소 제한적입니다. 당사의 표준 조건은 electroporation 당 4 x 105 셀을 생성합니다. 그러나 동일한 양의 RNP(미공개 데이터)를 사용하여 최대 2.4 x 106 세포를 사용한 10μL 반응에서 효율성이 감소하지 않기 때문에 수율을 크게 높일 수 있습니다. 또한 100μL 전기천공법 팁을 사용할 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 단점은 비용입니다. electroporator와 electroporation 소모품의 비용은 모두 상당합니다. 이러한 비용은 동일한 유전자를 표적으로 하는 다른 sgRNA를 사용할 때 팁을 재사용하고 독점 완충액 대신 PBS를 사용하여 크게 완화할 수 있습니다. 독점적 완충액의 조성은 알려져 있지 않지만, 0.9mMCaCl2 및 0.5mMMgCl2 를 갖는 PBS의 전해질 조성은 독점적 완충액의 전기 전도도에 근접한 것으로 추정된다. 이러한 변경 사항은 이 프로토콜에서 소모품 비용을 약 80% 절감합니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있으며, 편차는 유전자 편집의 효율성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 잠재적인 함정 중 하나는 높은 수율을 위해 설계되지 않은 표준 IVT 키트가 종종 불충분한 IVT 산물을 생산한다는 것입니다. 또한 저결합 튜브 대신 표준 폴리프로필렌 미세분리기 튜브를 사용하면 접착에 의해 상당한 세포 손실이 발생할 수 있습니다. IVT 산물의 불완전한 탈인산화 및 sgRNA 제제에 잔류 DNA의 존재는 대식세포 면역 센서의 활성화 및 후속 독성을 유발할 수 있습니다. 더 높거나 더 긴 전압 펄스는 또한 세포 사멸을 증가시킬 수 있습니다.
요약하면, Cas9-sgRNA RNP를 전달하기 위해 전기천공법을 사용하는 이 게놈 편집 프로토콜은 마우스 BMDM의 유전자를 파괴하는 효율적인 방법입니다. 이를 통해 사용자는 생체 내에서 대식세포의 복잡한 생물학을 보다 면밀히 재현하는 일차 세포의 표현형을 신속하게 스크리닝할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 5R01AI144149의 지원을 받았습니다. 회로도는 BioRender로 제작되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
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