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Genetics

इलेक्ट्रोपोरेटेड Cas9-sgRNA परिसरों का उपयोग करके प्राथमिक अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में उच्च दक्षता जीन व्यवधान

Published: August 4, 2023 doi: 10.3791/65264
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Internal Medicine, University of California, Davis, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of California, Davis

Summary

यह प्रोटोकॉल माउस अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज में जीनोम संपादन के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है Cas9-sgRNA राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसरों इन विट्रो में इकट्ठे और electroporation द्वारा वितरित.

Abstract

चूहों से अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) ऊतक मैक्रोफेज के जटिल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। प्राथमिक कोशिकाओं के रूप में, वे अमर मैक्रोफेज सेल लाइनों की तुलना में विवो में मैक्रोफेज के शरीर विज्ञान को अधिक बारीकी से मॉडल करते हैं और पहले से ही परिभाषित आनुवंशिक परिवर्तनों को ले जाने वाले चूहों से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, बीएमडीएम में जीन फ़ंक्शन को बाधित करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यहां, हम बीएमडीएम में कुशल सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 जीनोम संपादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो छोटे सम्मिलन और विलोपन (इंडल्स) की शुरूआत की अनुमति देता है जिसके परिणामस्वरूप फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन होते हैं जो जीन फ़ंक्शन को बाधित करते हैं। प्रोटोकॉल बताता है कि सिंगल-गाइड RNAs (sgRNA-Cas9) को कैसे संश्लेषित किया जाए और शुद्ध sgRNA-Cas9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (RNPs) बनाया जाए जिसे इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा वितरित किया जा सके। यह नियमित सेंगर अनुक्रमण और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऑनलाइन विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करके संपादन दक्षता की निगरानी के लिए एक कुशल तरीका भी प्रदान करता है। प्रोटोकॉल 1 सप्ताह के भीतर किया जा सकता है और प्लास्मिड निर्माण की आवश्यकता नहीं है; यह आमतौर पर 85% से 95% संपादन दक्षता में परिणत होता है।

Introduction

मैक्रोफेज जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं जो ऊतक की मरम्मत और प्रतिरक्षा 1,2 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। अमर मैक्रोफेज सेल लाइनें, जैसे कि माउस रॉ 264.7 कोशिकाएं या मानव टीएचपी-1 कोशिकाएं, में कई लाभकारी विशेषताएं हैं, जिनमें आरएनए हस्तक्षेप या सीआरआईएसपीआर/कैस 9 3,4 के लिए वैक्टर वितरित करके मजबूत विकास और जीन व्यवधान में आसानी शामिल है। हालांकि, ऑन्कोजेनिक परिवर्तन नाटकीय रूप से उनके शरीर विज्ञान को बदल देता है, जिसके परिणामस्वरूप कुछ मार्गों की असामान्य सक्रियता और दूसरों की मौन प्रतिक्रियाएं 5,6 हो जाती हैं। प्राथमिक अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (बीएमडीएम) अधिक बारीकी से विवो मैक्रोफेज शरीर क्रिया विज्ञान में recapitulate, लेकिन इन प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं 7,8 में प्लाज्मिड अभिकर्मक और वायरल पारगमन दोनों की कम दक्षता के कारण आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए चुनौतीपूर्ण रहते हैं. इस प्रकार, जीन फ़ंक्शन को बाधित करने के लिए अधिक कुशल तरीकों की आवश्यकता है।

CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन स्तनधारी कोशिकाओं 9,10,11,12सहित जैविक प्रणालियों की एक श्रृंखला में आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। स्ट्रेप्टोकोकस पायोजेनेस कैस 9 प्रोटीन कुशलतापूर्वक और विशेष रूप से अनुक्रम-विशिष्ट गाइड आरएनए के साथ जटिल होने पर डबल-फंसे डीएनए को साफ करता है। क्लीव्ड डीएनए के गैर-होमोलॉगस एंड जॉइनिंग (NHEJ) के माध्यम से डीएनए की मरम्मत के परिणामस्वरूप छोटे सम्मिलन या विलोपन (इंडल्स) होते हैं जो फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन बनाते हैं। प्रारंभिक अध्ययनों में, Cas9 और sgRNAs प्लास्मिड या lentiviral वैक्टर, जो कई सेल लाइनों 9,10 के लिए प्रभावी वितरण विधियां हैं के माध्यम से वितरित किए गए थे. हालांकि, प्राथमिक कोशिकाओं और, विशेष रूप से, प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं अक्सर अभिकर्मक या पारगमन द्वारा वेक्टर वितरण की कम दक्षता के कारण इन तरीकों के लिए दुर्दम्य हैं. इसके बाद, तरीकों इन विट्रो में sgRNA-Cas9 परिसरों उत्पन्न करने के लिए और उन्हें electroporation के माध्यम से वितरित करने के लिए विकसित किया गया है, और इन तरीकों सेल प्रकार13,14 की एक किस्म में उच्च दक्षता हासिल की है. परिणामों ने प्राथमिक मैक्रोफेज में जीनोम संपादन करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने की संभावना का सुझाव दिया है।

यहां, हम प्राथमिक बीएमडीएम में जीनोम संपादन करने के लिए एसजीआरएनए-कैस 9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (आरएनपी) का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसमें प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं में मौजूद प्रतिरक्षा सेंसर की सक्रियता को कम करने के लिए कदम होते हैं और न्यूनतम विषाक्तता के साथ लक्षित लोकी पर 95% संपादन होता है। इस प्रोटोकॉल में नियमित पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) और सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करके संपादन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए वर्कफ़्लो भी शामिल हैं, इसके बाद ट्रैकिंग ऑफ इंडल्स बाय डिकंपोजिशन (टीआईडीई)15, एक अच्छी तरह से मान्य ऑनलाइन सॉफ्टवेयर टूल द्वारा सिलिको विश्लेषण किया जाता है।

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Protocol

1. एसजीआरएनए डिजाइन

नोट: यह चरण एसजीआरएनए के लक्ष्य अनुक्रमों और डिजाइन के चयन का वर्णन करता है। यह उन गाइडों को डिजाइन करने में मददगार है जो पहले बड़े कोडिंग एक्सॉन में हैं, ताकि किसी भी अनुवादित प्रोटीन को खुले रीडिंग फ्रेम में जल्दी बाधित किया जा सके। यह लक्ष्य अनुक्रमों का चयन करने में भी सहायक होता है जो एक ही एक्सॉन के भीतर होते हैं, क्योंकि यह संपादन दक्षता (चरण 6) के विश्लेषण को सुव्यवस्थित करेगा। इस प्रोटोकॉल के साथ प्रदान किए गए जीनोम संपादन के उदाहरणों में SgrRNAs का उपयोग Src जीन और Cblb जीन के पहले एक्सॉन को लक्षित करने के साथ-साथ माउस जीनोम के गैर-कोडिंग Rosa26 स्थान में किया गया था।

  1. कई मुफ्त ऑनलाइन डिजाइनिंग टूल (तालिका 1) में से एक का उपयोग करके, लक्ष्य करने के लिए 20 न्यूक्लियोटाइड जीनोमिक अनुक्रमों की पहचान करें। चार से पांच गाइडों का चयन करें जो प्रत्येक जीन के भीतर गैर-अतिव्यापी हैं, क्योंकि Cas9 गतिविधि चुने गए विशिष्ट गाइड द्वारा भिन्न होती है, और अत्यधिक सक्रिय गाइड की प्राथमिकता भविष्यवाणी संभव नहीं है।
    नोट: लक्षित स्थान के अनुक्रम के सापेक्ष गाइड के उचित अभिविन्यास को सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। डिज़ाइन टूल आमतौर पर 5 'से 3' अभिविन्यास में गाइड अनुक्रम प्रदान करते हैं, भले ही क्रोमोसोमल स्ट्रैंड को लक्षित किया गया हो। स्ट्रैंड ओरिएंटेशन को सत्यापित करने के लिए, जांचें कि लक्षित जीनोमिक अनुक्रम के तुरंत 3' एस पायोजेनेस कैस 9 (एनजीजी) के लिए एक प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (पीएएम) अनुक्रम है। एसजीआरएनए अनुक्रम में पीएएम शामिल नहीं है।

2. एसजीआरएनए संश्लेषण

नोट: यह चरण वर्णन करता है कि इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (आईवीटी) के लिए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए पीसीआर का उपयोग करके एसजीआरएनए को कैसे संश्लेषित किया जाए, और फिर स्पिन कॉलम(चित्रा 1ए)का उपयोग करके एसजीआरएनए को शुद्ध करें। कस्टम सिंथेटिक एसजीआरएनए पीसीआर / आईवीटी के विकल्प के रूप में कई विक्रेताओं के माध्यम से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।

  1. T7 RNA पोलीमरेज़ के लिए IVT टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए PCR करें। पीसीआर प्रतिक्रिया सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग करती है जिसमें जीन-विशिष्ट गाइड अनुक्रम के साथ लघु व्यक्तिगत प्राइमरों के अलावा टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ प्रमोटर और ट्रांस-एक्टिवेटिंग सीआरआईएसपीआर आरएनए (ट्रैसीआरएनए) अनुक्रम (तालिका 2) होता है।
    1. यह गैर-प्रवर्धक ओवरलैप एक्सटेंशन चरण है। पीसीआर बफर को 1x तक पतला करें और अतिरिक्त 1 एमएम एमजीसीएल2 जोड़ें। फिर, 46 माइक्रोन की कुल मात्रा में उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़, 0.5 मिमी डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डीएनटीपी), 0.02 एमएम गाइड-विशिष्ट प्राइमर, और 0.02 एमएम टी 7 रिवर्स लंबे सार्वभौमिक प्राइमर (तालिका 2) के 0.25 माइक्रोन जोड़ें। फिर, ट्यूब को थर्मोसाइक्लर में रखें और दो चक्र चलाएं: 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 एस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 15 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। बर्फ पर प्रतिक्रियाओं को ठंडा करें।
    2. यह पीसीआर प्रवर्धन कदम है। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, 25 मिमी आगे प्रवर्धन प्राइमर के 2 माइक्रोन और 25 मिमी रिवर्स प्रवर्धन प्राइमर के 2 माइक्रोन जोड़ें। अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए डेनेचर 95 डिग्री सेल्सियस है। फिर, 35 चक्र चलाएं: 15 s के लिए 95 °C, 20 s के लिए 65 °C और 15 s के लिए 72 °C। 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त विस्तार प्रदर्शन करें।
    3. एक 2% agarose जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया उत्पाद की जाँच करें. ओवरलैप-एक्सटेंशन पीसीआर के परिणामस्वरूप जीन-विशिष्ट 20 न्यूक्लियोटाइड गाइड के T7 प्रमोटर अपस्ट्रीम के साथ 127 बीपी dsDNA अणु और तुरंत डाउनस्ट्रीम(चित्रा 1बी)tracrRNA होता है।
  2. आईवीटी टेम्पलेट शुद्धि: कई प्रोटोकॉल और किट हैं जो इसके लिए अच्छी तरह से काम करते हैं। यह प्रोटोकॉल ठोस-चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (SPRI) मोतियों का उपयोग करता है। पीसीआर उत्पाद के 50 माइक्रोन को 90 माइक्रोन मोतियों के साथ मिलाएं और निर्माता के निर्देशों का पालन करें। बफर (5 एमएम ट्रिस, 0.1 एमएम एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड [ईडीटीए]) के 40 माइक्रोन जोड़कर डीएनए को एल्यूट करें और 5 मिन के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  3. 260 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण का उपयोग कर आईवीटी टेम्पलेट के डीएनए एकाग्रता को मापें। आईवीटी के लिए कम से कम 50 एनजी/माइक्रोन की डीएनए एकाग्रता की आवश्यकता होती है। आईवीटी टेम्पलेट -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. आईवीटी प्रतिक्रिया
    1. आईवीटी की उच्च पैदावार का उत्पादन करने के लिए डिज़ाइन की गई एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। आईवीटी प्रतिक्रिया करने के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करें। 20 माइक्रोन प्रतिक्रिया में आईवीटी टेम्पलेट के 250 एनजी का उपयोग करके, 4-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. 2% अगारोज जेल पर प्रतिक्रिया के 1 माइक्रोन चलाकर आईवीटी एसजीआरएनए उत्पाद की जांच करें। एक उज्ज्वल आरएनए बैंड मनाया जाना चाहिए, 70 बीपी dsDNA (चित्रा 1C) के समान चल रहा है. हालांकि अनिवार्य नहीं है, तेज और अधिक हल बैंड प्राप्त करने के लिए, यूरिया के साथ एक आरएनए नमूना बफर का उपयोग करें, और लोड होने से पहले 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूना को विकृत करें।
      नोट: बेहोश उच्च आणविक भार बैंड और मामूली प्रवास मतभेद शाही सेना माध्यमिक संरचना में मतभेद के कारण कुछ गाइड आरएनए के साथ देखा जा सकता है.
  5. RIG-I (एक विदेशी RNA सेंसर) की सक्रियता को कम करने और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद बाद की कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए sgRNA IVT उत्पाद को डीफॉस्फोराइलेट करें। प्रत्येक 20 माइक्रोन आईवीटी प्रतिक्रिया के लिए, 1x सीआईपी बफर में आणविक-ग्रेड पानी के 69 माइक्रोन और बछड़े आंतों के फॉस्फेट (सीआईपी) के 15 यू जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. सेलुलर डीएनए सेंसर की सक्रियता को कम करने के लिए आईवीटी टेम्पलेट को नीचा दिखाएं, जो इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद कोशिका मृत्यु को ट्रिगर करता है। प्रत्येक आईवीटी प्रतिक्रिया के लिए, आरएनएएसई-मुक्त डीएनase के 2 यू जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं. आईवीटी उत्पाद को 1 दिन के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. स्पिन कॉलम का उपयोग करके आईवीटी उत्पाद को शुद्ध करें। इस चरण के लिए, एसपीआरआई मनका शुद्धि किट अवर हैं।
    1. आईवीटी उत्पाद में बाध्यकारी बफर के 220 माइक्रोन जोड़कर कॉलम में आरएनए को बांधें, इसके बाद 100% आणविक जीव विज्ञान-ग्रेड इथेनॉल के 1 एमएल के बाद। अच्छी तरह मिलाएं और कॉलम लोड करें। इसके बाद, निर्माता के निर्देशों का पालन करें। एसजीआरएनए के संदूषण से बचने के लिए एक लामिना का प्रवाह जैव सुरक्षा कैबिनेट में अंतिम धोने प्रदर्शन करें।
    2. संदूषण से बचने के लिए लामिना का प्रवाह हुड में क्षालन प्रदर्शन. बाँझ 10 मिमी ट्रिस बफर (पीएच 8.0) के 30 माइक्रोन का उपयोग करके आरएनए को एल्यूट करें।
  8. 260 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापकर एसजीआरएनए की एकाग्रता को मापें।
    नोट: विशिष्ट sgRNA पैदावार कम से कम 100 μg हैं।
  9. एसजीआरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। तीन से अधिक फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचने के लिए विभाज्य बनाएं।

3. इलेक्ट्रोपोरेशन की तैयारी

नोट: संदूषण से बचने के लिए सभी चरणों को एक लामिना का प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल 10 माइक्रोन युक्तियों के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करता है।

  1. उपयोग करने से पहले बीएमडीएम को 48-72 घंटे पिघलाएं और उन्हें गैर-ऊतक संस्कृति (टीसी) उपचारित प्लेटों पर विस्तारित करें।
    नोट: प्रति प्रतिक्रिया, 4 x 105 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है।
  2. प्रतिक्रिया विधानसभा के लिए पीसीआर ट्यूबों जीवाणुरहित. प्रतिक्रिया प्रति एक पीसीआर ट्यूब तैयार करें, और उन्हें 98 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए थर्मोसाइक्लर में गर्म करें। ट्यूबों को बैचों में तैयार करें और उन्हें बंद कर दें। उपयोग के लिए तैयार होने पर निष्फल पीसीआर ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
  3. 70% इथेनॉल के साथ विंदुक स्टेशन साफ और लामिना का प्रवाह हुड में जगह है. मापदंडों को 1,900 वी, 20 एमएस और एक पल्स पर सेट करें।
  4. देखभाल के साथ पैकेज से एक अभिकर्मक ट्यूब निकालें यह बाँझ रखने के लिए और यह "ई" बफर के 3 एमएल के साथ भरें. सुनिश्चित करें कि ई बफर electroporation से पहले कमरे के तापमान पर है. स्टेशन में ट्यूब डालें और इसे तब तक नीचे धकेलें जब तक कि यह क्लिक न कर दे।
  5. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, 1,100 ng/μL की एकाग्रता पर sgRNA के 2.5 μL विभाज्य 0.9 मिमी CaCl2 और 0.5 मिमी MgCl2 (पीबीएस + सीए / मिलीग्राम) के साथ ठंड फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में एसजीआरएनए को पतला करें। इसे बर्फ पर छोड़ दें।
  6. दो प्लेटें तैयार करें: कोशिकाओं के लिए एक 12 अच्छी तरह से uncoated प्लेट और संस्कृति मीडिया पकड़ करने के लिए एक अतिरिक्त 24 अच्छी तरह से थाली. विभाज्य 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में प्रति प्रतिक्रिया एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम के 1.5 एमएल.
  7. Cas9 प्रोटीन तैयार करें। बाँझ-शुद्ध Cas9 प्रोटीन के कई वाणिज्यिक और शैक्षणिक आपूर्तिकर्ता हैं। Cas9 को ठंडे PBS + Ca/Mg के साथ 20 माइक्रोन की अंतिम सांद्रता में पतला करें। प्रत्येक electroporation प्रतिक्रिया के लिए, विभाज्य बाँझ पीसीआर ट्यूबों में 20 माइक्रोन Cas9 के 1 माइक्रोन. बर्फ पर छोड़ दें।
  8. electroporation के लिए कोशिकाओं को तैयार.
    1. विकास माध्यम को हटा दें। आसंजन को बढ़ावा देने वाले सीरम और द्विसंयोजक धनायनों को हटाने के लिए CaCl2 और MgCl2 (PBS-Ca/Mg) के बिना पीबीएस का उपयोग करके कोशिकाओं को धोएं। फिर, पीबीएस + 1 एमएम EDTA जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू जब तक के बारे में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    2. पिपेट धीरे ऊपर और नीचे कोशिकाओं को अलग करने के लिए. कोशिकाओं को कम प्रोटीन-बाध्यकारी 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली मारो।
      नोट: मैक्रोफेज प्लास्टिकवेयर का पालन कर रहे हैं। कम प्रोटीन-बाध्यकारी अपकेंद्रित्र ट्यूबों का उपयोग सेल उपज में काफी सुधार करता है।
    3. पीबीएस + ईडीटीए में कोशिकाओं के लंबे समय तक इनक्यूबेशन से बचने के लिए जल्दी से काम करें। सतह पर तैरनेवाला के सबसे निकालें, ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला के बारे में 1 एमएल छोड़कर. शेष सतह पर तैरनेवाला में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और फिर एक कम प्रोटीन-बाध्यकारी 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. गिनती करने के लिए कोशिकाओं का एक छोटा सा विभाज्य निकालें. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 500 x ग्राम पर centrifuging द्वारा शेष कोशिकाओं गोली.
    5. सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान, कोशिकाओं की गिनती करें और कैस 9 और एसजीआरएनए ट्यूबों को कमरे के तापमान पर गर्म करें।
    6. सेल गोली से सभी सतह पर तैरनेवाला निकालें. 4 x 107 कोशिकाओं/एमएल (4 x 105 कोशिकाओं प्रति 10 माइक्रोन प्रतिक्रिया) की एकाग्रता पर पीबीएस + सीए/एमजी में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
      नोट: प्रत्येक किट electroporation बफर (बफर आर, बफर टी) की एक सीमित राशि के साथ आपूर्ति की है. हालांकि, हम पाते हैं कि पीबीएस + सीए/एमजी का उपयोग कर electroporation दक्षता मालिकाना बफ़र्स के बराबर है.
    7. विभिन्न जीनों के लिए एसजीआरएनए को इलेक्ट्रोपोरेटिंग करते समय, एसजीआरएनए के बीच क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक जीन के लिए कोशिकाओं को अलग-अलग प्रोटीन-बाध्यकारी ट्यूबों में विभाज्य करें। कमरे के तापमान पर कोशिकाओं रखें जब तक electroporation के लिए तैयार है.

4. आरएनपी विधानसभा

  1. वर्षा से बचने के लिए कमरे के तापमान पर sgRNA और Cas9 रखें। निष्फल पीसीआर ट्यूबों में पतला Cas9 के 1 माइक्रोन में sgRNA के 2.5 माइक्रोन जोड़ें। वर्षा को रोकने के लिए मिश्रण के साथ धीरे-धीरे 15 एस से अधिक sgRNA बांटना.
  2. आरएनपी जटिल गठन की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.

5. electroporation द्वारा RNP वितरण

  1. इलेक्ट्रोपोरेशन टिप (क्यूवेट) तैयार करें। स्टेम का विस्तार करने के लिए प्लंजर को दबाएं। स्टेम को टिप में डालें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि टिप सुरक्षित है और प्लंजर सुचारू रूप से स्लाइड करता है और टिप म्यान से आगे बढ़ता है। यदि टिप ठीक से तैनात नहीं है, तो टिप विफलता के कारण टिप में हवा के बुलबुले पेश किए जा सकते हैं।
  2. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspension, और फिर कोशिकाओं के साथ electroporation टिप लोड. बुलबुले से बचने, टिप की पूर्ण 10 माइक्रोन मात्रा क्षमता वापस ले लो.
  3. नकारात्मक नियंत्रण sgRNA के साथ शुरू, चरण 4 से RNP के 3.5 माइक्रोन युक्त नमूना ट्यूब के लिए electroporation टिप में कोशिकाओं के 10 माइक्रोन स्थानांतरण. पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए तीन बार. मिश्रण के 10 माइक्रोन को टिप में वापस ड्रा करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई बुलबुले मौजूद नहीं हैं।
  4. इलेक्ट्रोपोरेशन स्टेशन में टिप रखें, इसे बफर में कम करें। बाँझपन बनाए रखने के लिए टिप के साथ प्लास्टिक की सतहों से संपर्क करने से बचें। टचस्क्रीन डिस्प्ले पर पुश स्टार्ट ।
  5. पूरा होने के बाद, डिस्प्ले एक सफल पल्स का संकेत देगा। डिवाइस से विंदुक निकालें और लेबल की एक सूखी अच्छी तरह से में कोशिकाओं जगह, 12 अच्छी तरह से थाली uncoated.
  6. पीबीएस + सीए/एमजी के 15 एमएल में दो बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा टिप कुल्ला। टिप अभी भी संलग्न टिप के साथ विंदुक अलग सेट. सुनिश्चित करें कि टिप कुछ भी नहीं छूता है और बाँझ रहता है।
    नोट: कई प्रयोगों में, कई नमूनों के लिए टिप का पुन: उपयोग करना संभव है, जैसे कि निष्क्रिय नकारात्मक नियंत्रण एसजीआरएनए नमूने के बाद, या गाइड गतिविधि के प्रारंभिक मूल्यांकन के दौरान जब जीन प्रति चार से पांच एसजीआरएनए का परीक्षण किया जाता है और एकमात्र रीड-आउट संपादन दक्षता है। हालांकि, संपादित कोशिकाओं पर कार्यात्मक विश्लेषण के दौरान, प्रत्येक जीन के लिए एक नई टिप की सिफारिश की जाती है, क्योंकि एसजीआरएनए या सेल कैरीओवर की छोटी मात्रा प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकती है।
  7. तुरंत कोशिकाओं के लिए एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम (चरण 3.6 में aliquote) के 1 एमएल जोड़ें और धीरे मिश्रण करने के लिए थाली हिला.
  8. शेष प्रतिक्रियाओं के लिए 5.2-5.6 कदम दोहराएँ.
  9. इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं लौटें.
  10. कोशिकाओं की व्यवहार्यता की जाँच करें 1-2 घंटे के बाद electroporation. कोशिकाओं को >90% पालन करना चाहिए। वैकल्पिक: कोशिकाओं में जेंटामाइसिन (5 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें 1-2 घंटे के बाद इलेक्ट्रोपोरेशन संदूषण को रोकने में मदद करने के लिए अगर यह डाउनस्ट्रीम प्रयोगों में हस्तक्षेप नहीं करेगा।

6. संपादन दक्षता का आकलन करना

नोट: अधिकांश संपादन 48 घंटे के बाद पूरा हो गया है।

  1. इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद सेल मोनोलेयर 48 घंटे की जांच करें। यदि कोशिकाएं 50% से अधिक संगम हैं, तो आगे बढ़ें। यदि कोशिकाओं <50% संगम कर रहे हैं, एक अतिरिक्त 1-2 दिनों की प्रतीक्षा करें. संपादन दक्षता निर्धारित करने के लिए जीनोमिक डीएनए विश्लेषण के लिए डाउनस्ट्रीम प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं के अलावा, 1 x 105 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है।
  2. जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) तैयार करें।
    1. पीबीएस (-सीए / एमजी) के साथ कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस + 1 एमएम ईडीटीए के 1 एमएल जोड़ें। लगभग 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं जब तक कोशिकाओं थाली से अलग करने के लिए शुरू.
    2. पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को अलग करें। एक कम प्रोटीन-बाध्यकारी माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरण।
    3. कोशिकाओं की गणना करें और 1 x 105 कोशिकाओं का एक विभाज्य निकालें। शेष कोशिकाओं को आगे के प्रयोगों में उपयोग के लिए फिर से चढ़ाया जा सकता है. आम तौर पर, प्रयोगों 5 दिन electroporation के बाद आयोजित कर रहे हैं क्रम में प्रोटीन के क्षय की अनुमति देने के लिए.
    4. एक microfuge ट्यूब में अधिकतम गति पर 15 एस के लिए gDNA विश्लेषण के लिए कोशिकाओं गोली.
    5. lysis बफर के 50 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें। भंवर ट्यूब की दीवारों से चिपके किसी भी कोशिकाओं को अलग करने के लिए, और कोशिकाओं को लाइज़ करने और अंतर्जात DNase को निष्क्रिय करने के लिए 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी।
    6. बर्फ पर ट्यूबों प्लेस.
    7. 1 माइक्रोन प्रोटीनेज K (20 mg/mL) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं; सुविधा के लिए इसे रात भर छोड़ा जा सकता है।
    8. प्रोटीनेज के निष्क्रिय करने के लिए 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस तक गरम करें।
    9. अधिकतम गति पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें, जिसमें डीएनए होता है। आगे शुद्धि के बिना यह क्रूड तैयारी अधिकांश पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए अच्छी तरह से काम करती है।
  3. सेंगर अनुक्रमण के साथ संपादन दक्षता का मूल्यांकन करें।
    1. सबसे 5 'गाइड साइटों के 200-300 बीपी अपस्ट्रीम और सबसे 3' गाइड साइटों के 200-300 बीपी डाउनस्ट्रीम पीसीआर प्राइमरों को डिज़ाइन करें। विशिष्ट एम्प्लिकॉन आकार ~ 500 बीपी है। निकटतम गाइड साइट(चित्रा 2ए)से कम से कम 125 बीपी दूर एक नेस्टेड अनुक्रमण प्राइमर डिजाइन.
    2. जीडीएनए के 2 माइक्रोन का उपयोग करके पीसीआर करें।
  4. अनुक्रमण के लिए पीसीआर उत्पाद तैयार करें। यह प्रोटोकॉल एक एक्सोन्यूक्लिज़ I/झींगा क्षारीय फॉस्फेट (ExoI/SAP) उपचार का उपयोग करता है। वाणिज्यिक डीएनए शुद्धिकरण किट भी काम करते हैं लेकिन अधिक हाथों पर समय की आवश्यकता होती है।
    1. पीसीआर उत्पाद के 15 माइक्रोन तैयार करें। सेंगर अनुक्रमण में हस्तक्षेप करने वाले डीएनटीपी और प्राइमरों को नीचा दिखाने के लिए 7.5 माइक्रोन पानी, 10x एक्सोई बफर का 1 माइक्रोन, एक्सोई का 10 यू और एसएपी का 1 यू जोड़ें।
    2. एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए 20 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस के बाद 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. Exo/SAP-उपचारित PCR उत्पाद पर सेंगर अनुक्रमण करना; नमूने में मौजूद पीसीआर उत्पाद के आकार का अनुमान लगाने के लिए डीएनए आकार मार्कर की ज्ञात मात्रा का उपयोग करें। अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि TIDE सॉफ़्टवेयर को संपादन दक्षता का सटीक अनुमान लगाने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रम क्रोमैटोग्राम की आवश्यकता होती है। संयुक्त राष्ट्र संपादित स्थान के लिए अनुक्रम क्रोमैटोग्राम को न्यूनतम पृष्ठभूमि(चित्रा 2बी, सी)के साथ स्पष्ट चोटियों प्रदान करना चाहिए।
  6. संपादन दक्षता का अनुमान लगाने के लिए, संपादित gDNA और असंपादित नियंत्रण gDNA का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण क्रोमैटोग्राम फ़ाइलों का विश्लेषण करने के लिए TIDE का उपयोग करें। (तालिका 1, चित्र 2)। सेंगर अनुक्रमण फ़ाइलें अपलोड करें और सॉफ़्टवेयर को डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ चलाएँ।

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Representative Results

आईवीटी टेम्पलेट एक 127 बीपी पीसीआर उत्पाद (चित्रा 1 बी) है। पूर्ण लंबाई आईवीटी उत्पाद एक 98 एनटी आरएनए है, जो 70 बीपी डबल-फंसे डीएनए टुकड़े(चित्रा 1सी)के समान माइग्रेट करता है।

इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, कोशिकाओं को >90% व्यवहार्य होना चाहिए, जिसमें शुरुआती सेल नंबर का >70% की कुल सेल गिनती हो। उत्परिवर्ती कोशिकाओं के परिणामस्वरूप पूल indels का एक विविध सेट होना चाहिए, Cas9 दरार साइट के पास शुरू. पीसीआर और सेंगर अनुक्रमण द्वारा लक्षित जीन के विश्लेषण Cas9 दरार साइट (चित्रा 2) के बहाव प्रत्येक स्थिति में कई nucleotides दिखाना चाहिए.

Figure 1
चित्र 1: sgRNA-Cas9 संपादन प्रक्रिया का अवलोकन। (ए) गाइड डिजाइन, sgRNA पीढ़ी और Cas9-sgRNA डिलीवरी के लिए योजनाबद्ध। (बी) एसआरसी एसजीआरएनए 1, 2, और 3 के लिए आईवीटी से पीसीआर उत्पाद 2% अगारोज जेल पर हल हो गया। तीर सही 127 बीपी पीसीआर उत्पादों को इंगित करता है। (सी) एसआरसी एसजीआरएनए 1, 2, और 3 के लिए आईवीटी के बाद आरएनए उत्पादों को 2% अगारोज जेल पर हल किया गया। कोष्ठक सही sgRNA उत्पादों को इंगित करते हैं। एसजीआरएनए का परिवर्तनशील प्रवास आरएनए माध्यमिक संरचना के कारण होता है। यह आंकड़ा पहले लेखक के मास्टर की थीसिस16 से पुनर्मुद्रित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कई लक्षित जीन के लिए हासिल की गई उच्च संपादन दक्षता। (ए) पीसीआर और सेंगर अनुक्रमण प्राइमरों का योजनाबद्ध। (बी) संपादन दक्षता का आकलन करने के लिए TIDE के लिए वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। (सी) बीएमडीएम से आरओएसए 26 लोकस के प्रतिनिधि सेंगर अनुक्रमण क्रोमैटोग्राम एक नियंत्रण गैर-लक्ष्यीकरण एसजीआरएनए-कैस 9 आरएनपी (शीर्ष) और आरओएसए 26-विशिष्ट एसजीआरएनए (नीचे) के साथ इलेक्ट्रोपोरेटेड; Cas9 दरार साइट पर प्रकाश डाला गया है। गणना की गई संपादन दक्षता के साथ TIDE आउटपुट (दाएं) और इंडल्स की संकेतित संख्या को परेशान करने वाले अनुक्रमों का प्रतिशत। (डी, ई) संपादित बीएमडीएम में (डी) एसआरसी और सीबीएलबी जीन के क्रोमैटोग्राम अनुक्रमण सेंगर "। यह आंकड़ा पहले लेखक के मास्टर की थीसिस16 से पुनर्मुद्रित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: वाणिज्यिक electroporation बढ़ाने के कारण संपादन दक्षता में मध्यम वृद्धि. बीएमडीएम को एक वाणिज्यिक संपादन बढ़ाने के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए कम दक्षता वाले गाइड के साथ इलेक्ट्रोपोरेटेड किया गया था। इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले, एन्हांसर के 1 माइक्रोन को इकट्ठे आरएनपी में 4 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में जोड़ा गया था। संकेतित Src sgRNA की संपादन दक्षता का मूल्यांकन TIDE का उपयोग करके किया गया था। यह आंकड़ा पहले लेखक के मास्टर की थीसिस16 से पुनर्मुद्रित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उपकरण का नाम यूआरएल
सिंथेगो - सीआरआईएसपीआर डिजाइन टूल https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool
ब्रॉड इंस्टीट्यूट - CRISPick https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
अपघटन द्वारा इंडल्स की ट्रैकिंग (TIDE) http://shinyapps.datacurators.nl/tide/

तालिका 1: ऑनलाइन टूल के URL.

प्राइमर का नाम अनुक्रम
गाइड-विशिष्ट प्राइमर ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa
गाइड-विशिष्ट प्राइमर - सीबीएल-बी गाइड 3 ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa
गाइड-विशिष्ट प्राइमर - सीबीएल-बी गाइड 4 ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAAAATATCAAGTATAgttttagagctagaa
गाइड-विशिष्ट प्राइमर - रोजा ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTCTCTAGAgttttagagctagag
गाइड-विशिष्ट प्राइमर - हाथापाई ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa
गाइड-विशिष्ट प्राइमर - एसआरसी गाइड 2 ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGAGAGGGGAATCAGAGgttttagagctagaa
गाइड-विशिष्ट प्राइमर - एसआरसी गाइड 5 ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCAAGCCCAgttttagagagctagaa
गाइड-विशिष्ट प्राइमर - एसआरसी गाइड 6 ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa
T7 रिवर्स लॉन्ग यूनिवर्सल प्राइमर aaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaactgctatttctagctctaaaac
यूनिवर्सल फॉरवर्ड एम्प्लीफिकेशन प्राइमर ggatcctatacgactcactatag
यूनिवर्सल रिवर्स एम्प्लीफिकेशन प्राइमर aaaaaaagcaccgactcgg

तालिका 2: एसजीआरएनए के आईवीटी के लिए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए पीसीआर में उपयोग किए जाने वाले ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स। जीन-विशिष्ट प्राइमरों के लिए 20 न्यूक्लियोटाइड लक्ष्य अनुक्रम पूंजीकृत हैं।

बीएमडीएम ग्रोथ मीडिया। 4 सी पर स्टोर करें।
डीएमईएम
भ्रूण गोजातीय सीरम 0.1
एल-ग्लूटामाइन 0.2 एम
3T3-MCSF कोशिकाओं से MCSF सतह पर तैरनेवाला ** 0.1
सोडियम पाइरूवेट 11 मिलीग्राम/एमएल
लाइसिस बफर। 4 सी पर स्टोर करें।
2-mercaptoethanol (तुरंत उपयोग करने से पहले जोड़ें) 0.01
एमजीसीएल2 5 मिमी
ट्रिस 20 मिमी
ट्राइटन-एक्स 100 0.005
**3T3-MCSF कोशिकाओं को DMEM+10% FCS में उगाया जाता है। एमसीएसएफ के साथ सतह पर तैरनेवाला 100% संगम तक पहुंचने के बाद 5 वें दिन काटा जाता है। एक विकल्प के रूप में, 10ng/ml पुनः संयोजक एमसीएसएफ वातानुकूलित मीडिया के बदले इस्तेमाल किया जा सकता है

तालिका 3: मीडिया और बफ़र्स की रचनाएँ।

अनुपूरक फ़ाइल 1: ROSA_ मॉक के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 2: ROSA_TargettingGuide के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 3: स्क्रैम्बलगाइड के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 4: SrcG5+SrcG6 के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 5: CBLB_Mock के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 6: CBLB_TargetingGuide के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 7: Mock_Guide2Locus के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 8: Mock_Guide6Locus के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 9: SrcGuide2_Enhancer के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 10: SrcGuide2_NoEnhance के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 11: SrcGuide6_Enhancer के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 12: SrcGuide6_NoEnhancer के लिए कच्ची अनुक्रमण फ़ाइल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इलेक्ट्रोपोरेटेड Cas9-sgRNA परिसरों का उपयोग करके जीनोम संपादन BMDMs में जीन फ़ंक्शन के प्रभावी व्यवधान की अनुमति देता है। संपादन दक्षता लक्ष्य अनुक्रम और जीन द्वारा भिन्न होती है। आमतौर पर, चार से पांच एसजीआरएनए को आम तौर पर अत्यधिक सक्रिय एक की पहचान करने के लिए जांच की जाती है। कुछ लोकी में संपादन क्षमता कम होती है, सबसे अधिक संभावना क्रोमैटिन संरचना के कारण होती है। इन मामलों में, संपादन दक्षता बढ़ाने के लिए कई संशोधन किए जा सकते हैं। एक ही एक्सॉन में दो सक्रिय एसजीआरएनए की सह-डिलीवरी के परिणामस्वरूप कुछ जीनों के लिए बेहतर संपादन होता है। हालांकि, जब दो गाइड सह-ट्रांसफ़ेक्ट होते हैं, तो हमने देखा है कि टाइड सटीकता खो सकता है। इसलिए, संपादन का आकलन करने के लिए वैकल्पिक तकनीकों, जैसे कि पश्चिमी सोख्ता, की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध NHEJ बढ़ाने वाले को शामिल करने से अक्सर संपादन दक्षता ~ 20% बढ़ जाती है (चित्र 3)।

इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं। कोशिकाओं को sgRNA-Cas9 की प्रत्यक्ष डिलीवरी बीएमडीएम को स्थानांतरित करने के लिए प्लास्मिड निर्माण या लेंटिवायरल वेक्टर उत्पादन के समय लेने वाले चरणों की आवश्यकता नहीं होती है। एसजीआरएनए, इलेक्ट्रोपोरेशन को संश्लेषित करने और उत्परिवर्ती कोशिकाओं को उत्पन्न करने की प्रक्रिया 1 सप्ताह में पूरी की जा सकती है। इस तकनीक का उपयोग डबल-उत्परिवर्ती कोशिकाओं को बनाने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से प्राप्त बीएमडीएम के साथ भी किया जा सकता है। हालांकि रासायनिक तरीकों siRNA या mRNA17 के साथ प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट करने के लिए मौजूद, इन रासायनिक तरीकों प्रतिरक्षा कोशिकाओं18 के लिए Cas9-sgRNA परिसरों देने में electroporation से काफी कम प्रभावी हैं. व्यावसायिक रूप से कई प्रकार के इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण उपलब्ध हैं। इन उपकरणों को Cas9-sgRNA परिसरों के वितरण के लिए समान रूप से काम करने की उम्मीद है, हालांकि वोल्टेज मापदंडों को प्रत्येक व्यक्तिगत डिवाइस के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। जबकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग मुख्य रूप से माउस बीएमडीएम पर किया गया है, सीमित प्रयोगों में, चूहे बीएमडीएम (अप्रकाशित डेटा) के साथ इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए गए हैं। यह संभव है कि अन्य प्रकार के प्राथमिक मैक्रोफेज, जैसे माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज या वायुकोशीय मैक्रोफेज, भी इस दृष्टिकोण के लिए उत्तरदायी हो सकते हैं, हालांकि इसका अभी तक परीक्षण नहीं किया गया है।

इस विधि की कुछ सीमाएँ हैं। इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित कोशिकाओं की संख्या कुछ हद तक सीमित है; हमारी मानक स्थितियां इलेक्ट्रोपोरेशन प्रति 4 x 105 कोशिकाएं उत्पन्न करती हैं। हालांकि, उपज को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाना संभव हो सकता है, क्योंकि आरएनपी (अप्रकाशित डेटा) की समान मात्रा का उपयोग करके 2.4 x 106 कोशिकाओं के साथ 10 माइक्रोन प्रतिक्रिया में दक्षता कम नहीं होती है। इसके अलावा, 100 माइक्रोन इलेक्ट्रोपोरेशन टिप्स उपलब्ध हैं। इस पद्धति का एक और दोष खर्च है; इलेक्ट्रोपोरेटर और इलेक्ट्रोपोरेशन उपभोग्य सामग्रियों दोनों की लागत पर्याप्त है। इन खर्चों को एक ही जीन को लक्षित करने वाले विभिन्न एसजीआरएनए का उपयोग करते समय युक्तियों का पुन: उपयोग करके और मालिकाना बफ़र्स के बजाय पीबीएस का उपयोग करके काफी कम किया जा सकता है। जबकि मालिकाना बफ़र्स की रचनाएँ ज्ञात नहीं हैं, संभवतः 0.9 मिमी CaCl2 और 0.5 मिमी MgCl2 के साथ पीबीएस की इलेक्ट्रोलाइट संरचना मालिकाना बफर के विद्युत चालकता का अनुमान लगाती है। ये परिवर्तन इस प्रोटोकॉल में उपभोग्य सामग्रियों की लागत को लगभग 80% तक कम करते हैं।

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, जिनमें से विचलन नाटकीय रूप से जीन संपादन की दक्षता को प्रभावित कर सकता है। संभावित नुकसानों में से एक यह है कि मानक आईवीटी किट, जो उच्च पैदावार के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए हैं, अक्सर अपर्याप्त आईवीटी उत्पाद का उत्पादन करते हैं। इसके अलावा, कम-बाध्यकारी ट्यूबों के बजाय मानक पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रोफ्यूज ट्यूबों का उपयोग आसंजन द्वारा महत्वपूर्ण कोशिका हानि का कारण बन सकता है। आईवीटी उत्पाद के अपूर्ण डीफॉस्फोराइलेशन और एसजीआरएनए तैयारी में अवशिष्ट डीएनए की उपस्थिति के परिणामस्वरूप मैक्रोफेज प्रतिरक्षा सेंसर और बाद में विषाक्तता की सक्रियता हो सकती है। उच्च या लंबे समय तक वोल्टेज दालों भी वृद्धि हुई कोशिका मृत्यु में परिणाम हो सकता है.

सारांश में, यह जीनोम संपादन प्रोटोकॉल, जो Cas9-sgRNA RNPs देने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करता है, माउस BMDMs में जीन को बाधित करने का एक कुशल तरीका है। यह उपयोगकर्ताओं को प्राथमिक कोशिकाओं में फेनोटाइप के लिए तेजी से स्क्रीन करने की अनुमति देता है जो विवो में मैक्रोफेज के जटिल जीव विज्ञान को अधिक बारीकी से पुन: व्यवस्थित करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान 5R01AI144149 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। योजनाबद्ध आंकड़े BioRender के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3T3-MCSF Cell Line Gift from Russell Vance not applicable
Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer IDT 1075915
Ampure XP Reagent Beads Beckman Coulter A63880
Calf intestinal alkaline phosphatase NEB M0525S
DNase NEB M0303S
DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) Thermo Fisher 14040-133
DPBS -Ca/Mg Thermo Fisher 14190-144
ExoI NEB M0293S
Fetal Calf Serum (FCS) Corning 35-015-CV
Herculase DNA polymerase & buffer Agilent 600677
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit NEB E2040S
LoBind conical tubes 15 mL Eppendorf 30122216
LoBind Eppendorf tubes 2 mL Eppendorf 22431102
NEBuffer r2.1 NEB B6002S
Neon Transfection System Thermo Fisher MPK5000, MPP100, MPS100
Neon Transfection System 10 uL Tips Thermo Fisher MPK1025 or MPK1096
PBS + 1mM EDTA Lonza BE02017F
Proteinase K Thermo Fisher EO0491
rCutSmart Buffer for ExoI NEB B6004S
Ribolock Thermo Fisher EO0384
RNA loading dye NEB B0363S
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
S. pyogenes Cas9-NLS University of California Macro Lab not applicable Available to non-UC investigators through  https://qb3.berkeley.edu
S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation IDT 1081059
SAP NEB M0371S

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References

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Craft, J., Truong, T., Penn, B. H. High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes. J. Vis. Exp. (198), e65264, doi:10.3791/65264 (2023).

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