Summary
Denne protokol beskriver høst og visualisering af elasmoide skæl af zebrafisk under in vivo regenerering. Derudover præsenteres ex vivo-kulturen af disse skalaer i op til 7 dage efter høst.
Abstract
Skeletsygdomme er ofte komplekse i deres ætiologi og påvirker millioner af mennesker verden over. På grund af den aldrende befolkning er der behov for nye behandlinger, der kan lette byrden på sundhedssystemerne. Da disse sygdomme er komplekse, er det vanskeligt og dyrt at modellere knoglepatofysiologi nøjagtigt i en laboratorieindstilling. Udfordringen for feltet er at etablere en omkostningseffektiv, biologisk relevant platform til modellering af knoglesygdom, der kan bruges til at teste potentielle terapeutiske forbindelser. En sådan platform bør ideelt set tillade dynamisk visualisering af celleadfærd af knogleopbyggende osteoblaster og knoglenedbrydende osteoklaster, der virker i deres mineraliserede matrixmiljø. Zebrafisk bruges i stigende grad som modeller på grund af tilgængeligheden af genetiske værktøjer, herunder transgene reporterlinjer, og det faktum, at nogle skeletvæv (inklusive skalaerne) forbliver gennemskinnelige til voksenalderen, hvilket muliggør dynamiske billeddannelsesmuligheder. Da zebrafiskskæl har både osteoblaster og osteoklaster og er meget rigelige, giver de en let tilgængelig og rigeligt tilgængelig ressource af uafhængige knogleenheder. Desuden regenererer voksne zebrafiskskæl, når de er fjernet, fuldt ud og tilbyder derfor en måde at studere den rumlige tidsmæssige vækst af mineraliseret væv in vivo. Her beskriver vi protokoller til høst og sporing af regenerering af skalaerne. Endelig præsenteres også en protokol for stabil kultur af skalaer ex vivo i en uge og efter helingsresponsen efter kontrolleret skade på skalaens mineraliserede matrix over tid.
Introduction
Knogle er et hårdt bindevæv, der udgør en stor del af skelettet, muliggør bevægelse og fungerer som en mineralreserve i kroppen. For at opretholde sunde knogler er en udsøgt balance mellem knogledannelse og nedbrydning afgørende via den koblede aktivitet af osteoblaster (som er anabolske) og osteoklaster (som resorberer knogle). Denne balance forstyrres af aldring eller hormonel ubalance, hvilket ofte fører til knoglesvaghedssygdomme som osteoporose1. Selvom eksisterende lægemidler er blevet godkendt til at målrette knoglesvaghedssygdomme, har mange bivirkninger; Derfor er der behov for nye behandlinger1. Der er således fortsat behov for rigelige kilder til biologisk relevant knoglevæv, der kan bruges til at teste potentielle terapeutiske forbindelser.
Traditionelt er gnavermodeller og cellekultursystemer blevet brugt til at studere knoglebiologi. Imidlertid bliver zebrafisk i stigende grad en anden model af valg. Selvom det ikke er et pattedyrsystem, tilbyder zebrafisk visse fordele for knogleforskning i forhold til gnavere; Disse omfatter deres fecundity og larvernes gennemskinnelighed; Selv i voksenalderen forbliver nogle skeletvæv, herunder skæl og finner, gennemsigtige, hvilket muliggør høj opløsning in vivo-billeddannelse og øget tilgængelighed af skeletmutanter 2,3. Både finner og skalaer af zebrafisk er i stand til fuldstændig regenerering efter fjernelse. Skeletregenerering og skadesreparation af zebrafiskefinner er blevet undersøgt grundigt 4,5, mens zebrafiskskæl er en nyere knoglemodel i marken, men giver fordele for ex vivo-kultur 6.
Vægte er meget rigelige, med mindst 300 skalaer på hver fisk, der tjener som et beskyttende dække for fisken. Hver skala er en lille mineraliseret plade bestående af knogledannende osteoblaster og knogleresorberende osteoklaster af en kollagenrig skeletmatrix7. Forbeningsprocessen af både zebrafiskskalaer og menneskelige knogler kræver differentiering af mesenkymale stamceller i osteoblaster for at danne den mineraliserede matrix. Zebrafiskeskæl giver en stor fordel for skeletforskning med deres stærke regenerative evne, der kan bruges til at studere knogleregenerering og reparation. På trods af tilstedeværelsen af både osteoblaster og osteoklaster mangler zebrafiskskalaer imidlertid osteocytter, der er vigtige for human knoglemodellering og mekanosensation; Den overfladiske placering af skalaerne betyder, at de let kan fjernes med et par tang. Ved fjernelse af skalaen opstår der en kaskade af begivenheder, og skalaregenerering begynder 8,9. Der er forskellige farvnings- og billeddannelsesmuligheder til rådighed for at visualisere aktiviteten af osteoblaster og osteoklaster og mineraliseringen af skalaerne, som vist i figur 1. Derudover betyder tilgængeligheden af mange relevante fluorescerende transgene reporterlinjer af zebrafisk, at man kan visualisere celledynamikken under regenerering 7,10,11. Denne proces gør det muligt at få mere forståelse af de novo knogledannelse ved at observere det tidlige mønster af skalaregenerering på fiskens flanke for at studere morfologi, cellulær aktivitet og genetiske profiler af disse regenererede skalaer. Biologien bag skaladannelse og regenerering er blevet godt karakteriseret. Det er vigtigt, at skalaer kan vise en god prædiktiv evne til terapeutisk relevante forbindelser12, og behandling af fisk med glukokortikoider fører til en skala, der regenererer for at vise osteoporotiske fænotyper13. Transskriptomet af de regenererende skalaer viser, at gener, der aktiveres i skalaregenerering, beriges for dem, der er knyttet til menneskelige skeletsygdomme, hvilket yderligere demonstrerer deres relevans som et modelsystem 6,14.
Endelig kan disse skalaer dyrkes ex vivo i op til 7 dage. Sammenlignet med cellelinjekulturer, der typisk består af en enkelt celletype, giver ex vivo-skalakultur in vitro-knogleundersøgelsesmuligheder inden for sit naturlige miljø, der indeholder både osteoblaster og osteoklaster med sin naturlige ekstracellulære matrix 8,12,15,16.
Skalakultur giver os også mulighed for at udføre lægemiddelscreening for nye osteoanabolske mål. Overfloden af skalaer på fisken betyder, at man kan fylde mindst to plader af 96-brøndpladen fra kun en enkelt fisk, hvilket giver mulighed for sammensat screening i et multiwell-format, hvor hver enkelt brønd indeholder en skala sammen med sin naturlige niche af celler. Da skalaerne desuden er tynde, er lægemiddelabsorptionen forudsigelig12. Sammenfattende har zebrafiskens elasmoide skæl et stort potentiale i skeletforskning og kan hjælpe os med at få mere indsigt i de cellulære begivenheder under knogledannelse og reparation. Her beskriver vi protokoller for høstskalaer for at følge regenerering in vivo og dyrke skalaerne ex vivo.
Protocol
University Animal Scientific Unit (ASU) er ansvarlig for zebrafiskpleje under vejledning af retningslinjer for zebrafiskhold. Alle procedurer, herunder høst af skala, levende knoglefarvning og levende billeddannelse, blev godkendt og udført under en UK Home Office Project License (PP4700996). Til dette manuskript blev unge voksne transgene zebrafisk fra linjen sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46] brugt17. Fisken omfattede både hanner og hunner på 4 måneder.
1. Regenerering i in vivo-skala
- Før skalaregenereringsforsøget påbegyndes, overføres zebrafisk fra deres hovedtanke til individuelle tanke (se materialetabel) og vender tilbage til disse individuelle tanke efter billeddannelse under hele eksperimentet, som vist i figur 2. Dette er for at sikre, at alle regenererende skalaer er dem, der høstes til forsøget; Gruppehus kan føre til sporadisk tab af skalaer på grund af skader forårsaget af andre fisk.
BEMÆRK: Fiskene placeres individuelt for at undgå kamp og efterfølgende skæltab mellem fiskene. - Registrer oplysninger for hver forsøgsfisk (dvs. genotype, alder og køn) i henhold til eksperimentdesignet. Brug et kamera (smartphone-kameraer fungerer fint) til at tage et billede af hver fisk ved siden af en lineal for at registrere fiskens størrelse / længde og sundhedstilstand.
- På forsøgsdagen bedøves zebrafisken med 0,05% (v/v) tricainmethansulfonat (MS222, se materialetabel) ved nedsænkning, og placer den derefter på en petriskål med et fugtigt væv for at undgå, at fisken bevæger sig under billeddannelse eller høst.
- Placer fisken på sin side (typisk bruges venstre flanke her for konsistens). Udfør flankebilleddannelse ved hjælp af et stereomikroskop med passende forstørrelse (typisk blev 2x, 4x og / eller 6,3x og 8x brugt til denne undersøgelse for at fange både det samlede regenererende område og det zoomede område til detaljeret observation).
BEMÆRK: Tidspunkterne for billeddannelse på flanken afhænger af det eksperimentelle formål og valg af transgene reportere. For eksempel for at spore osteoblaster under skalaregenerering er de foreslåede tidspunkter dag 0 (ontogenetisk), 2 dage efter høst (dph), 4 dph, 7 dph, 10 dph, 14 dph, 21 dph. For at reducere virkningerne fra gentagen anæstesi skal du holde billeddannelsestidspunkter til det færreste, der kræves til eksperimentet. - Høstskalaer ved hjælp af fin pincet og tang under stereomikroskopet. Overfør de høstede skalaer til opsamlingsrør til kalkfarvning senere.
BEMÆRK: Det maksimale antal skalaer, der kan høstes, afhænger af lokale etiske godkendelser, der er på plads. Vi høster typisk omkring 20 til 30 skalaer og samler dem i individuelle opsamlingsrør til skalafarvning senere, såsom ALP, von Kossa14. - Opsaml vægten i enten et 1,5 ml eller 2 ml opsamlingsrør. Dette afhænger af den anvendte farvningsteknik.
- Til både ALP- og von Kossa-farvning overføres skalaerne til opsamlingsrør indeholdende deioniseret vand, mens skalaerne til TRAP-farvning eller immunhistokemi overføres til opsamlingsrør indeholdende 4% PFA (fikseringsopløsning).
- Valgfrit: Før du overfører skalaer til rør, skal du tage billeder af individuelle høstede skalaer, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Foreslåede høsttidspunkter for skala er dag 0 (ontogenetisk), dag 10 og dag 21 (regenererede skalaer).
2. Levende knoglefarvning
BEMÆRK: Levende skeletfarvning kan udføres, enten når forsøgsfisk ikke er transgene for fluorescerende reportere, eller når de bærer enkeltfarvede transgene reportere. Levende farvning kan bruges til at supplere transgene; for eksempel kan man bruge en osteoblastreporter som sp7 / osx i en farve (f.eks. GFP) og derefter plette knoglen i rødt med Alizarinrød (AR). AR og calcein grøn kan bruges til den samme fisk sammen; i dette scenario bruges AR til at mærke original eller ontogenetisk knogle ved binding til den mineraliserede matrix af alderen knogle, og calcein binder til calciumioner, der er rigelige i nydannet knogle. For eksempel, når farvning af en ontogenetisk skala, kan AR visualiseres, men calceingrøn kan være fraværende eller minimal, da ontogenetiske skalaer har lave niveauer af ny knogledannelse.
- Udfør levende Alizarin Red (AR) farvning.
- Forbered en flaske 2x AR-farvningsopløsning ved at blande 0,5% (w / v) lager Alizarin-opløsning (10 ml) med 10 ml 1 M lager HEPES (slutkoncentration, 10 mM) (se materialetabel).
- Fyld op til 1 liter med 1x Danieau-opløsning (se Materialetabel). Opløsningen skal opbevares i mørke eller indpakkes med folie.
- På forsøgsdagen skal du bringe 500 ml 2x AR-opløsning til zebrafiskanlægget og tilføje 500 ml systemvand (fra akvariet) for at lave 1x fungerende AR-opløsning.
- Overfør fisk fra deres tanke til en 1x fungerende AR-farvningsopløsning og lad den stå i 15-20 minutter. Vask den overskydende plet på fisken af med 15 min 'vask' i systemvandet.
- Udfør live Calcein Green-farvning.
- Forbered en flaske 2x Calcein Green farvningsopløsning ved at tilsætte 45 mg Calcein pulver i 900 ml 1x Danieau opløsning (se tabel over materialer). Brug en magnetisk omrører til at lade pulveret opløses fuldstændigt.
- Juster pH til 8. Dette er 2x lager Calcein Green løsning. Opløsningen kan opbevares i mørke/indpakket med folie i op til 1 måned.
- På forsøgsdagen bringes 500 ml 2x Calcein Green-opløsning til zebrafiskanlægget, og der tilsættes 500 ml systemvand for at lave 1x fungerende Calcein Green-opløsning. Det anbefales at bruge frisklavet Calcein-farvningsopløsning.
- Overfør fisk fra deres tanke til 1x fungerende Calcein Green farvningsopløsning og lad den stå i 1-2 timer. Afhængigt af fiskens størrelse kan der kræves en længere farvningstid.
- Vask den overskydende plet på fisken af med 15 min 'vask' i systemvandet.
BEMÆRK: Forestil dig Calcein Green farvede fisk så hurtigt som muligt, da denne plet vil falme om et par timer.
3. Alkalisk fosfatase (ALP) farvning på skalaer efter høst
- Forbered ALP-farvningsopløsningen ved at blande 100 mM Tris (pH 9,5 med HCI) med 100 mM NaCl og 50 mM MgCl2.
- Brug kommercielt tilgængelig NBT/BCIP-stamopløsning (se materialetabel).
- Overfør skalaerne til rør indeholdende deioniseret vand.
- Skyl skalaerne i ALP-farvningsopløsning i 5 min.
- I mellemtiden skal du forberede en fungerende farvningsopløsning ved at tilsætte 200 μL af NBT / BCIP-opløsningen til 10 ml ALP-farvningsbuffer. Dette skal være frisklavet på farvningstidspunktet.
- Plet skalaerne med den fungerende ALP-farvningsopløsning i 15 min.
- Stop reaktionen ved at skylle skalaerne med deioniseret vand.
4. Von KOSSA-farvning på skalaer efter høst
- Forbered 5% (w/v) sølvnitratopløsning.
- Forbered 5% (w / v) natriumthiosulfatopløsning.
- Overfør høstede skalaer til rør indeholdende deioniseret vand.
- Skællene inkuberes i sølvnitratopløsningen i 40 minutter under stærkt lys.
BEMÆRK: Brug PPE (personlige værnemidler), da sølvnitrat efterlader en plet, der er vanskelig at fjerne. - Vask vægten to gange i 5 min med deioniseret vand.
OBS: Sølvnitrataffald skal indsamles og bortskaffes efter lokale retningslinjer. - Inkuber skalaerne i natriumthiosulfat i 5 min.
- Vask vægten to gange i 5 min med deioniseret vand.
5. Kolorimetrisk TRAP-farvning
BEMÆRK: For den detaljerede procedure henvises til tidligere offentliggjort arbejde18.
- Forbered farvningsopløsningerne.
- Forbered 10 mg/ml Naphthol AS-MX fosfatopløsning.
- Der afvejes 5 mg Naphthol AS-MX-phosphat (se materialetabel).
- I damphætten fremstilles et rør med 0,5 ml N, N'-dimethylformamid, og 5 mg Naphthol AS-MX-phosphat opløses i 0,5 ml N, N'-dimethylformamid for at fremstille en stamopløsning af 10 mg/ml Naphthol AS-MX-phosphat (omrystes forsigtigt).
- Forbered 1,6 mM Fast Red Violet LB stamopløsning i 50 mM natriumtartrat.
- Forbered 50 ml 0,1 M natriumacetat ved pH 5 (tilsæt 0,41015 g natriumacetat i 50 ml deioniseret vand og juster pH til 5 med 100% eddikesyre).
- 0,575 g natrium-L-tartrat dibasisk dihydrat (se materialetabel) opløses i 50 ml 0,1 M natriumacetatbuffer (pH = 5).
- Tilsæt 30 mg hurtigt rødviolet LB-salt.
- Forbered PBS-0,1Tx (opløs 500 μL Triton-X i 500 ml PBS).
- Forbered PBS-0,1Tw (opløs 500 μL Tween-20 i 500 ml PBS).
- Forbered 10 mg/ml Naphthol AS-MX fosfatopløsning.
- Forbered en fungerende TRAP-løsning.
- Bland begge stamopløsninger sammen i stinkhætten (0,5 ml 10 mg/ml Naphthol AS-MX-fosfatopløsning og 50 ml 1,6 ml Fast Red Violet LB-stamopløsning i 50 mM natriumtartrat).
BEMÆRK: Arbejdsløsningen kan nu bruges uden for stinkdækslet. Det kan opbevares i køleskabet (indpakket i folie) i op til en måned. Opbevares i separate beholdere fra antistoffer eller andre reagenser, der er følsomme over for fikseringsmidler. Hold dig væk fra lys så meget som muligt. - Valgfrit: Forbered blegningsopløsning (på postfikserede prøver, der var TRAP-farvede) i PBS og 0,1% Tween-20 (PBS-0,1% Tw).
- Forbered en endelig koncentrationsblanding af 0,5% kaliumhydroxid (KOH) (fra 10% stamopløsning (w / v)) og 3% hydrogenperoxid (H2O2) (33% stamopløsning, opbevaret i køleskabet).
- Bland begge stamopløsninger sammen i stinkhætten (0,5 ml 10 mg/ml Naphthol AS-MX-fosfatopløsning og 50 ml 1,6 ml Fast Red Violet LB-stamopløsning i 50 mM natriumtartrat).
- Udfør prøvefiksering.
- Fastgør vægte i 4% PFA i 1x PBS, der vipper eller roterer i 40 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Fjern 4% PFA og vask med PBS-0.1Tx mindst 3 gange i 5 minutter hver vask.
- Flyt direkte til TRAP-farvning (den bedste tilgang) eller opbevar i PBS-0.1 Tx natten over.
- Udfør TRAP-farvning af skalaerne.
- PBS-0,1 Tx-opløsningen fjernes, og den kolorimetriske TRAP-arbejdsløsning (trin 5.2.1) tilsættes for at dække prøverne fuldstændigt (dvs. 1 ml i et 1,5 ml mikrocentrifugeglas).
- Inkuber i 1-2 timer ved RT, rocking i mørket.
- Fjern farvningsopløsningen og vask mindst 3 gange med PBS-0,1 Tw i 5 minutter hver vask.
- Efterfiks prøverne i 4% PFA i 30 minutter ved RT, vugge forsigtigt i mørket.
- PFA-opløsningen fjernes ved at vaske 3 gange med PBS-0,1 Tw i 5 minutter hvert trin.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares (i opbevaringsopløsninger/monteret på mikroskopglas) ved 4 °C i mørke på ubestemt tid.
6. Montering af farvede skalaer
- Forbered monteringsmediet ved at tilsætte 2,4 g Mowiol 4-88 krystaller til 6 g glycerol (se materialetabel). Alle foretrukne monteringsmedier kan bruges.
- Tilsæt 6 ml deioniseret vand og lad det stå på en magnetisk omrører i en time.
- Der tilsættes 12 ml 0,2 M Tris (pH 8,5) og inkuberes ved ca. 53 °C, indtil Mowiol-krystallerne opløses helt.
- Opløsningen klares ved centrifugering ved 2000 x g i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Overfør opløsningen til en opbevaringsbeholder. Monteringsmediet kan opbevares i fryseren i ca. 12 måneder. Den optøede Mowiol-opløsning er stabil i op til 1 måned.
- Monter skalaerne på et mikroskopglas i montering af mediet, dæk dem med et dæksel og se dem under et mikroskop.
7. Ex vivo-dyrkning af skæl
BEMÆRK: Dette trin er tilpasset fra de Vrieze et al.12.
- Før du høster skalaerne i et sterilt miljø, skal du forberede det osteogene mediumog kulturpladen.
- Osteogent kulturmedium (OCM): I et sterilt centrifugerør fremstilles 15 ml OCM i standardcellekulturmedium (høj glukose, ingen glutamin, ingen phenolrød) ved de endelige koncentrationer af 1% bovin kalveserum, 1% (200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl), 1% antibiotika/antimykotisk opløsning (100x) opløsning, 4 mM CaCl2, 10 mM β-glycerophosphat, 1 nM natriumpyruvat og 1% amfotericin B (valgfrit) (se materialetabel).
- Hæld OCM i et sterilt reagensreservoir, og brug en multikanalpipette til at tilsætte 100 μL til hvert hul i 96-brøndpladen.
- Forsegl 96-brøndpladen og opbevar pladen. OCM kan opbevares i køleskab i en kort periode (natten over til 1 uge) og opbevares ved 28 °C før brug.
- Udfør skalahøst og PBS-vask.
- Vægten høstes med steril pincet/pincet og lægges i en petriskål, der indeholder en steril PBS-opløsning.
- Udfør pladeopsætning.
- Hver skala overføres fra petriskålen til hver brønd på 96-brøndpladen med 100 μL OCM (opvarmet til 28 °C) ved hjælp af sterile pincet.
- Når alle skalaer er overført til pladen, bringes pladen under et stereomikroskop. Brug en fin, steril pipettespids til forsigtigt at flytte hver skala til bunden af brønden og holde dem væk fra siden af brøndene for at undgå lysrefleksion under billedoptagelse.
BEMÆRK: Dette trin kræves kun, hvis du udfører live-billedbehandling. - Pladen overføres forsigtigt til inkubatoren eller Live Imaging System (LIS, se materialetabellen) (indstillet til 28 °C, 5% CO2), hvor skællene kan dyrkes i op til 7 dage.
- Opdater OCM (valgfrit).
- OCM, der blev opbevaret i køleskabet, opvarmes til 28 °C.
- Overfør forsigtigt 96-brøndpladen til et sterilt miljø. Brug en multikanalpipette til at aspirere 50 μL fra hvert hul. For dette skal du trykke spidserne mod væggene og ikke dyppe dem indtil bunden for at undgå at aspirere / flytte / fjerne skalaerne. Brug nye tips til forskellige forhold.
- Hæld OCM i et sterilt reagensreservoir, og brug multikanalpipetten til at tilsætte 60 μL OCM til hvert hul.
- Placer pladen under stereomikroskopet, og kontroller for forkert placerede skalaer (for tæt på væggene, flydende eller lodret i mediet). Placer dem om nødvendigt igen med en fin, steril pipettespids.
- Sæt pladen tilbage i inkubatoren/LIS.
BEMÆRK: Opdater ikke mediet, hvis eksperimentet involverer døgnrytme (CR), da serumchok kan påvirke det biologiske ur. Bemærk, hvis du studerer CR, bemærker, at lysforholdene også nulstiller uret.
- Udfør farvning og billeddannelse efter kulturskala (valgfrit).
- Efter 6 dages kultur skal du rette dem og lede dem til passende farvning som von Kossa og ALP nævnt ovenfor.
- Alternativt, hvis forsøgsfisken har et fluorescerende mærke, skal du sætte pladen i et levende billeddannelsessystem.
BEMÆRK: Hvis du bruger et levende billedbehandlingssystem, skal du sikre dig, at det er indstillet til et temperatur- og CO2 -niveau, der passer til eksperimentet. I denne undersøgelse blev der typisk anvendt 28 °C og 5% CO2 . Vælg passende filtre og billeddannelsestidspunkter (her blev der anvendt et interval på 2 eller 4 timer, som er tilstrækkeligt til at følge osteoblastmigration) og mål for lav forstørrelse (dvs. 4x) for at sikre jævn billeddannelse af hele brøndene. Dette skyldes, at skalaerne har tendens til at bevæge sig inde i brøndene, især under medieændringer.
Representative Results
Regenerering af skala
Skalaregenerering kan spores med et standard fluorescerende stereomikroskop ved at afbilde zebrafiskens flanke. Figur 3A viser ændringer i sp7/osx-ekspressionen af skællene under skalaregenerering hos en 4 måneder gammel zebrafisk. Tidspunkter for flankebilleddannelse vist i figur 3A er ontogenetiske (originale skalaer før høst), dag 2, dag 4 og dag 10 efter høst. Vi bruger typisk osx (også kendt som osterix eller sp7) transgene linjer (enten som en GFP (Tg (Ola.sp7: NLS-eGFP) 19 eller mCherry Tg (osterix: mCherry-NTR) pd46) 17 til at spore ændringer i skeletsystemet, da det mærker knogleproducerende osteoblaster. Tidlig mønster af nydannede skalaer kan ses på 2 dages regenerering. Dette tidlige mønster af skalaregenerering forstyrres i nogle tilfælde, især hos skeletmutanter. Ved at spore regenereringsforløbet kan man analysere regenereringskapaciteten og -hastigheden. På skalahøstdagen kan individuel billeddannelse af høstede skalaer udføres efter flankebilleddannelse ved hjælp af det samme stereomikroskop, som vist i figur 3B. Regenererede skalaer har meget højere osx-ekspression sammenlignet med dag 0 ontogenetiske skalaer, fordi osteoblaster er nødvendige for den nye knogledannelse.
Ex vivo-skalakultur
Selvom man kan studere de novo knogledannelsesprocessen ved at spore regenereringsprocessen på fiskens flanke, kan vi også bruge denne model til at studere reparation og heling af skeletskader med ex vivo skalakultur ved at lave en skade på skalaerne med en skalpel. Ved hjælp af et live billedbehandlingssystem kan reparationen spores i realtid. Figur 4 viser et repræsentativt resultat af et skadehelingsrespons på en ontogenetisk skala på 3 dage i en kultur, hvor osteoblasterne er mærket med osx: mCherry. Skadesstedet vist ved indsatserne i begyndelsen af kulturen viser et klart mellemrum mellem osteoblaster og skala circuli (figur 4A). Man kan overvåge migrationen af osteoblaster mod skadestedet med time-lapse billeddannelse. Efter 3 dage i kultur reduceres gabets bredde, ogekspressionen af osx kan ses mellem mellemrummet og den nydannede skala circuli (figur 4B). Derudover er morfologien med hensyn til osteoblasternes form mere cirkulær i begyndelsen af kulturen og efter 3 dage er den mere langstrakt. Denne ændring i osteoblast udseende skyldes sandsynligvis at være i kultur og ikke i sit naturlige miljø (knyttet til fisken).
Figur 1: Eksempler på billedbehandlingsmuligheder for vægte. Osteoblaster kan visualiseres med osx / sp7 transgene reporterlinjer (enten i GFP eller mCherry). ALP-farvning kan bruges til at vise osteoblastaktiviteten. TRAP-farvning kan vise osteoklasters aktivitet. Alizarin rød (AR) og Calcein grøn er begge farvestoffer, der kan bruges i levende fisk; AR mærker mineralisering og Calcein mærker nydannet knogle. Omfanget af mineralisering kan også vises med von Kossa-farvning. Skalabjælker: 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk illustration af et skalaregenereringseksperiment. Generisk skema over et skalaregenereringseksperiment, der viser, at fisk adskilles i individuelle tanke før forsøget. Længde, køn og sundhed registreres. Skemaet viser også det foreslåede område på fiskens flanke for at høste skalaer og foreslåede billeddannelsestidspunkter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative billeder af osterix-ekspression (for at visualisere osteoblaster) under skalaregenerering taget fra en 4 måneder gammel zebrafisk. (A) Flankebillederne taget på dag 0 (før høst, ontogenetiske skalaer), 2 dph (dage efter høst) dag 2, 4 dph og 10 dph til sporing af ændringer i OSX-ekspression . Skalastænger: 1 mm. (B) Repræsentative billeder af en ontogenetisk skala og en skala ved 10 dph taget fra den samme fisk som i panel (A). Bemærk de øgede niveauer af osx-ekspression som vist i magenta i midten af de regenererende skalaer. Skalabjælker: 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative resultater af respons på reparation af skeletskader på en ontogenetisk skala fanget fra en 4 måneder gammel zebrafisk ved hjælp af et levende billeddannelsessystem. (A) Ontogenetiske skalaer med en skade forårsaget af skalpel samme dag som høst (tidspunkt 0/dag0) af kulturen. (B) Den samme skala vises 3 dage efter skaden. Indsats viser skadeområdet. Skalabjælker: 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Zebrafiskens elasmoide skæl, som en ny model for skeletforskning, har et stort potentiale til at hjælpe vores forståelse af knoglevedligeholdelse, regenerering og skadereparation. Overfloden af skalaer på fisk giver mulighed for medium til høj kapacitet sammensat screening, samtidig med at antallet af anvendte dyr reduceres og begrænses intra-individuel variation. Her præsenteres protokoller for skalaregenerering og ex vivo-skalakultur for at studere regenerering og reparation.
Nogle kritiske trin skal overvejes, når du følger denne protokol. Omhyggelig fjernelse af skalaerne er afgørende, især når man bruger en transgen reporterlinje for at begrænse forstyrrelsen af cellepopulationen forårsaget af høst. Hvis der skal foretages sammenligninger med ontogenetiske skalaer, skal du sikre dig, at regionen ikke indeholder spontant regenererende skalaer (som naturligt kan forekomme gennem fiskens levetid). Sørg for, at miljøet og udstyret er sterilt til ex vivo-kultur for at opnå optimal celleoverlevelse og minimal infektion i kultur.
Afhængigt af det specifikke forskningsspørgsmål kan der foretages tilpasninger til protokollen, såsom at kombinere forskellige transgene reporterlinjer for at visualisere andre celletyper af genekspressionsprofiler under regenerering og reparation11,14.
Den brede vifte af farvning, man kan udføre på skalaerne, betyder, at man for hver testet forbindelse eller tilstand kan se på dens virkninger på knoglen fra forskellige vinkler; mens sp7 / osx-journalister kan vise osteoblastnumre, ALP-farvning kan visualisere osteoblastaktivitet, TRAP-farvning kan visualisere osteoklastaktivitet, Calcein-grøn levende farvning kan mærke nydannende knogle og Alizarin-rød eller von Kossa-farvning kan vise mineralisering i skala. Luciferaseaktivitet til kvantificering af osteoblaster kan også anvendes12. Kombineret med disse farvningsteknikker kan man lære det relative bidrag fra osteoblaster og osteoklaster til en given knogleeffekt. Vægte mangler osteocytter, som er udbredt i pattedyrs knogler og er de vigtigste drivkræfter for knoglemekanosensorisk respons; Skalareparation og regenerering i denne model er primært drevet af osteoblaster med efterfølgende ombygning af osteoklaster 8,9. Det er afgørende at bemærke, at der forekommer variation mellem individer og aldersgrupper20. For at minimere dette skal skalaens høstareal være konstant, da forskellige placeringer kan give anledning til forskellige skalamorfologier, og fisk fra de samme søskendegrupper bruges, så alder og størrelse er konsistente. Men fordi der kan høstes flere skalaer pr. Fisk, kan man køre flere eksperimenter med færre fisk, hvilket reducerer variationen inden for individet.
Sammenfattende viser disse protokoller eksperimentelle teknikker, der kan anvendes på ontogenetiske og regenererende skalaer. Afslutningsvis viser elasmoidskalaer stort potentiale som skeletmodel til at hjælpe forståelsen af knogledannelse og reparation; og vil bidrage til at reducere brugen af dyr til screening af osteoanabolske forbindelser med høj kapacitet.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Mathew Green fra Animal Service Unit for fiskehold og Katy Jepson fra Wolfson Bioimaging Centre. CLH, DB og QT blev finansieret af Versus Arthritis (CLH Senior Fellowship 21937, DB og QT Intermediate Fellowship 22044), RR blev finansieret af (NHMRC APP1158758). Dette arbejde blev også støttet af BBSRC-tilskuddet (BB/T001984/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 70013-016 | PBS |
| 12-Multichanel Pipette | Sartorius | 728230 | Multichanel pipette, Proline Plus Mechanical Pipette, 12 Channel, , 10-100 µL. |
| 15 mL Centrifuge tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tube, CentriStar Cap, Polypropylene, RNAse/DNAse free, Non-pyrogenic |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | PFA |
| Alizarin red | Sigma | A5533 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290026 | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher Scientific | 11772644 | Sealing film |
| Calcein powder | Sigma | C0875 | |
| Calcium Chloride | Thermo Scientific | L13191.30 | |
| Corning 96 well plate | Corning | 3596 | 96-well-plate, Clear, Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Cover slips | VWR | 631-0146 | |
| Cytiva HyClone Iron-Supplemented Calf Serum | Fisher Scientific | SH30072.03 | |
| Danieau | Sigma | ||
| DMEM | Life Technologies | 31053 | |
| Falcon tubes | Corning | 430828 | |
| Fast Red Violet LB stock solution | Sigma | F3381 | |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050 | |
| Glycerol | Sigma | 81381 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Incubator | X | Incubator, Set up to 28 °C and 5% CO2 | |
| IncuCyte Zoom | Sartorious | X | Live Imaging System, Set up to 28 °C and 5% CO2 |
| Leica stereomicroscope | X | Sterioscope | |
| L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma | 228729 | |
| Mgcl2 | BDH Laboratory Sup. | 261237T | |
| Microscope slides | Epredia | J2800AMNZ | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| MQ water | X | ||
| N, N’-dimethylformamide (Merck: D4451) | Merck | D4451 | |
| NaCL | Fisher Chemical | S/3120/53 | |
| Naphthol AS-MX phosphate | Merck | N4875 | |
| NBT/BCIP solution | Sigma | #000000011681451001 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140 | |
| Petri Dishes | Corning | 430589 | 35 mm sterile Petri dish, Non-treated, Nonpyrogenic, Polystyrene. |
| Reagent Reservoir | Startub | E2310-1025 | 25mL Reagent Reservoir |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | |
| Sodium acetate | Sigma | 52889 | |
| Sodium beta-glycerophosphate pentahydrate | Thermo Scientific | L03425.14 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636 | |
| Sodium tartrate | Sigma | S4797 | |
| Sodium thioculphate | Sigma | 563188 | |
| Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma | E10521 | |
| Tris | Sigma | 252859 | |
| Triton-X100 | Sigma | T8787 | |
| Tween-20 | SLS | CHE3852 | |
| Tweezers Number 5 | Dumont | 500341 | Tweezer, INOX, biology grade |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 3.5 L - 28 cm x 11 cm x 17 cm |
| Zebrafish tanks | Tecniplast | ZB30BCP | 1 L - 28 cm x 7 cm x 11 cm |
References
- Tobias, J. H., et al. Opportunities and challenges in functional genomics research in osteoporosis: report from a workshop held by the causes working group of the osteoporosis and bone research academy of the Royal Osteoporosis Society on October 5th 2020,". Frontiers in Endocrinology. 11, (2021).
- Busse, B., Galloway, J. L., Gray, R. S., Harris, M. P., Kwon, R. Y. Zebrafish: An emerging model for orthopedic research. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 925-936 (2020).
- Dietrich, K., et al. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. Journal of Bone and Mineral Research. 36 (3), 436-458 (2021).
- McGowan, L. M., Kague, E., Vorster, A., Newham, E., Cross, S., Hammond, C. L. Wnt16 elicits a protective effect against fractures and supports bone repair in zebrafish. JBMR Plus. 5 (3), 10461 (2021).
- Sehring, I., Weidinger, G. Zebrafish fin: Complex molecular interactions and cellular mechanisms guiding regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (7), 040758 (2022).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10 (6), (2019).
- Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, 37001 (2018).
- Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Developmental Biology. 437 (2), 105-119 (2018).
- Metz, J. R., de Vrieze, E., Lock, E. J., Schulten, I. E., Flik, G. Elasmoid scales of fishes as model in biomedical bone research. Journal of Applied Ichthyology. 28 (3), 382-387 (2012).
- Cox, B. D., De Simone, A., Tornini, V. A., Singh, S. P., Di Talia, S., Poss, K. D. In toto imaging of dynamic osteoblast behaviors in regenerating skeletal bone. Current Biology. 28 (24), 3937-3947 (2018).
- Tonelli, F., et al. Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders,". Frontiers in Endocrinology. 11, (2020).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex-vivo sp7: Luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
- De Vrieze, E., Moren, M., Metz, J. R., Flik, G., Lie, K. K. Arachidonic acid enhances turnover of the dermal skeleton: Studies on zebrafish scales. PLoS One. 9 (2), 89347 (2014).
- Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biology. 20 (1), 21 (2022).
- Bergen, D. J. M., et al. High bone mass disorders: New insights from connecting the clinic and the bench. Journal of Bone and Mineral Research. , John Wiley and Sons Inc. (2022).
- Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell and Tissue Research. 350 (1), 69-75 (2012).
- Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Developmental Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
- Ethiraj, L. P., Fong, E. L. S., Liu, R., Chan, M., Winkler, C., Carney, T. J. Colorimetric and fluorescent TRAP assays for visualising and quantifying fish osteoclast activity. European Journal of Histochemistry. 66 (2), 3369 (2022).
- DeLaurier, A., et al. Zebrafish sp7:EGFP: a transgenic for studying otic vesicle formation, skeletogenesis, and bone regeneration. Genesis. 48 (8), 505 (2010).
- Carnovali, M., Banfi, G., Mariotti, M. Age-dependent modulation of bone metabolism in zebrafish scales as new model of male osteoporosis in lower vertebrates. Geroscience. 43 (2), 927-940 (2021).
