מערכת מודל מעי תלת-ממדית בסיסית (3D) עם מרכיב חיסוני
Summary
כאן אנו מתארים בניית מערכת מודל בסיסית תלת ממדית (3D) של קו תאי מעי ופרוטוקול הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות. צביעה של חלבונים נבחרים מאפשרת ניתוח של פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד לשימוש פוטנציאלי במחקרי סינון תרופות פרה-קליניים.
Abstract
חלה עלייה בשימוש במודלים של מעיים in vivo ו – in vitro לחקר הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים דלקתיות, לסינון פרמקולוגי של חומרים שעשויים להיות מועילים, ולמחקרי רעילות על רכיבי מזון שעלולים להיות מזיקים. רלוונטיות, קיים כיום ביקוש לפיתוח מודלים מבוססי תאים במבחנה שיחליפו מודלים של בעלי חיים. כאן, פרוטוקול למודל תלת-ממדי תלת-ממדי (3D) תלת-ממדי בסיסי של “רקמה בריאה” באמצעות קווי תאים מוצג עם היתרון הכפול של מתן פשטות ניסיונית (מערכת מתוקננת וניתנת לחזרה בקלות) ומורכבות פיזיולוגית (אנטרוציט Caco-2 עם מרכיב חיסוני תומך של מונוציטים U937 ופיברובלסטים L929). הפרוטוקול כולל גם הטבעה של פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות, ובכך מספק את היתרון של ניתוח פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד. חלקים מוכתמים של Hematoxylin ו-eosin (H&E) המראים את תאי העמוד Caco-2 היוצרים שכבה חד-שכבתית הדוקה וסדירה בטיפולי בקרה משמשים לאימות יעילות המודל כמערכת ניסויית. שימוש בגלוטן כמרכיב מזון פרו-דלקתי, פרמטרים שנותחו מקטעים כוללים ירידה בעובי החד-שכבתי, כמו גם הפרעה וניתוק מהמטריצה הבסיסית (H&E), ירידה בביטוי חלבון בצומת הדוק כפי שמוצג מצביעת אוקלודין (ניתן לכימות סטטיסטי), והפעלת מערכת החיסון של תאי U937 נודדים כפי שניתן לראות מצביעת צביעת צביעת התמיינות 14 (CD14) והתמיינות הקשורה ל- CD11b למקרופאגים. כפי שניתן לראות על ידי שימוש בליפופוליסכריד כדי לדמות דלקת מעיים, פרמטרים נוספים שניתן למדוד הם צביעת ריר מוגברת וביטוי ציטוקינים (כגון מידקין) שניתן להפיק מהמדיום לפני הקיבוע. ניתן להמליץ על מודל תלת מימדי (3D) בסיסי של רירית המעי ומקטעים קבועים למחקרי סטטוס דלקתי ותקינות מחסום עם אפשרות לנתח פרמטרים חזותיים מרובים הניתנים לכימות חזותי.
Introduction
מחסום האפיתל של המעי, רירית פנימית בעובי תא אחד המכילה סוגים שונים של תאי אפיתל, מהווה את מחסום ההגנה הפיזי הראשון או ממשק בין הסביבה החיצונית והפנימית של הגוף 1,2. אנטרוציטים מסוג עמודה מהווים את הסוג הנפוץ ביותר של תאי אפיתל. אלה אחראים לשמירה על שלמות מחסום האפיתל באמצעות אינטראקציות בין מספר רכיבי מחסום, כולל צמתים הדוקים (TJs), הממלאים תפקיד משמעותי בהידוק מחסום 1,3. מבנה TJ מורכב מחלבוני פלאק תוך-תאיים, כגון zonula occludens (ZO) ו-cingulin, המשתפים פעולה עם חלבונים טרנסממברנליים, כולל אוקלודינים, קלאודינים ומולקולות היצמדות צמתיות (JAMs) היוצרות מבנה דמוי רוכסן המקשר בחוזקה בין התאים השכנים 3,4. החלבונים הטרנסממברנליים מווסתים את הדיפוזיה הפארא-תאית הפסיבית של תרכובות קטנות ואינם כוללים מולקולות גדולות רעילות.
תרכובות מזון רעילות פוטנציאליות ומזהמי מזון מעוררים ייצור ציטוקינים דלקתיים המשבשים את חדירות האפיתל, מפעילים את תאי החיסון וגורמים לדלקת כרונית ברקמת המעי 5,6,7. לעומת זאת, פיטוכימיקלים נוגדי חמצון ואנטי דלקתיים שונים דווחו כמפחיתים את ביטוי הציטוקינים הדלקתיים ומשפרים את שלמות מחסום TJ במעי באמצעות שיקום ביטוי והרכבה של חלבון TJ 4,6,8. לפיכך, הרגולציה של שלמות מחסום האפיתל על ידי תרכובות מועילות ומזיקות כאחד ראתה עלייה בשימוש הן במודלים in vivo והן במודלים במבחנה שמטרתם לחקות את מחסום המעי לבדיקות סקר תרופתיות ומחקרי רעילות. זה רלוונטי במיוחד לאור העניין הגובר בהבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות מעיים (IBD), אנטרוקוליטיס נמקית וסרטן, שניתן לדמות במודלים ניסיוניים 8,9,10.
יש ביקוש לפיתוח מודלים מבוססי תאים במבחנה על מנת להשיג את המטרה של “3Rs” בניסויים בבעלי חיים. אלה כוללים חלופות חלופיות לשימוש בבעלי חיים, צמצום מספר בעלי החיים בשימוש, ועידון באימוץ שיטות להקלת מצוקה 11,12,13. יתר על כן, המנגנונים המולקולריים, התאיים והפיזיולוגיים הבסיסיים בין מודלים אנושיים ומורין (מכרסמים הם המין הנפוץ ביותר) הם ייחודיים, מה שמוביל למחלוקת לגבי יעילותם של המודלים המורין כמנבאים בתגובות אנושיות12,13. יתרונות רבים של מודלים של קו תאים אנושי במבחנה כוללים ניסויים מוגבלי מטרה, תצפית ישירה וניתוח רציף13.
חד-שכבות מסוג תא בודד בתרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות) שימשו כמודלים רבי עוצמה. עם זאת, אלה אינם יכולים לשחזר במדויק את המורכבות הפיזיולוגית של רקמות אנושיות 8,13,14. כתוצאה מכך, מערכות תרבית תלת-ממדיות מפותחות עם שיפורים הולכים וגדלים כדי לשחזר את המורכבות הפיזיולוגית של רקמות מעיים בריאות וחולות כאחד כארגזי כלים להערכת סיכונים של הדור הבא13,14. מודלים אלה כוללים פיגומים תלת-ממדיים של Transwell עם קווי תאים מגוונים, תרביות אורגנואידים והתקנים מיקרופלואידים (מעי-על-שבב) המשתמשים הן בקווי תאים והן באורגנואידים (שמקורם הן ברקמות בריאות והן ברקמות חולות)8,13,14.
פרוטוקול המקבילה התלת-ממדי של “רקמה בריאה” במעי שהוצג במחקר הנוכחי התבסס על מציאת איזון בין מורכבות פיזיולוגית לבין פשטות ניסויית13. המודל מייצג פיגום טרנסוול תלת-ממדי, המורכב משלושה קווי תאים (אנטרוציטים [קו אדנוקרצינומה Caco-2 של המעי הגס הסטנדרטי בזהב] עם מרכיב חיסוני תומך [מונוציטים U937 ופיברובלסטים L929]), המהווים מערכת מתוקננת וניתנת לחזרה בקלות הישימה לסינון ראשוני של מולקולות תזונתיות בעלות עניין על שלמות מחסום האפיתל של המעי ותגובה חיסונית. הפרוטוקול כולל הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של שלמות מחסום האפיתל באמצעות מקבילות מעי קבועות. היתרון של הגישה הנוכחית הוא שניתן לגרום לחלקים רבים של הרקמות המשובצות להכתים עבור פרמטרים מרובים מניסוי יחיד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת המודל הבסיסית המשוחזרת של רירית המעי המוצגת כאן (איור 6) משלבת מורכבות פיזיולוגית (תרביות תאים תלת-ממדיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית המכילות שכבה חד-שכבתית Caco-2 עם תמיכה עשירה ב-ECM lamina propria המכילה פיברובלסטים ומונוציטים) עם פשטות ניסיונית (שימוש בקווי תאים אנושי?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה לקרן אומברטו ורונסי על מלגה התומכת בעבודת חוקר.
Riferimenti
- Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
- Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
- Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
- Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
- Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
- Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
- Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
- Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , (2023).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
- Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
- Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn’s disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
- Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
- Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
- Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
