Sistema modello intestinale tridimensionale (3D) di base con una componente immunitaria

Summary

Qui descriviamo la costruzione di un sistema modello di linea cellulare intestinale tridimensionale (3D) di base e un protocollo di inclusione della paraffina per la valutazione microscopica ottica di equivalenti intestinali fissi. La colorazione di proteine selezionate consente l’analisi di più parametri visivi da un singolo esperimento per un potenziale utilizzo in studi preclinici di screening farmacologico.

Abstract

Si è registrato un aumento dell’utilizzo di modelli intestinali in vivo e in vitro per lo studio della fisiopatologia delle malattie infiammatorie intestinali, per lo screening farmacologico di sostanze potenzialmente benefiche e per studi di tossicità su componenti alimentari potenzialmente dannosi. Di rilievo è l’attuale domanda di sviluppo di modelli in vitro basati su cellule per sostituire i modelli animali. Qui, viene presentato un protocollo per un modello di base equivalente intestinale tridimensionale (3D) di “tessuto sano” utilizzando linee cellulari con il duplice vantaggio di fornire sia semplicità sperimentale (sistema standardizzato e facilmente ripetibile) che complessità fisiologica (enterociti Caco-2 con una componente immunitaria di supporto dei monociti U937 e dei fibroblasti L929). Il protocollo include anche l’inclusione della paraffina per la valutazione al microscopio ottico degli equivalenti intestinali fissi, fornendo così il vantaggio di analizzare più parametri visivi da un singolo esperimento. Le sezioni colorate con ematossilina ed eosina (H&E) che mostrano le cellule colonnari Caco-2 che formano un monostrato stretto e regolare nei trattamenti di controllo sono utilizzate per verificare l’efficacia del modello come sistema sperimentale. Utilizzando il glutine come componente alimentare pro-infiammatorio, i parametri analizzati dalle sezioni includono la riduzione dello spessore del monostrato, nonché l’interruzione e il distacco dalla matrice sottostante (H & E), la diminuzione dell’espressione proteica della giunzione stretta come mostrato dalla colorazione dell’occludina (quantificabile statisticamente) e l’attivazione immunitaria delle cellule U937 in migrazione come evidenziato dalla colorazione del cluster di differenziazione 14 (CD14) e dalla differenziazione correlata a CD11b in macrofagi. Come dimostrato dall’uso del lipopolisaccaride per simulare l’infiammazione intestinale, ulteriori parametri che possono essere misurati sono l’aumento della colorazione del muco e l’espressione di citochine (come midkine) che possono essere estratte dal terreno prima della fissazione. Il modello tridimensionale di base (3D) della mucosa intestinale e le sezioni fisse possono essere consigliati per studi sullo stato infiammatorio e sull’integrità della barriera con la possibilità di analizzare molteplici parametri visivi quantificabili.

Introduction

La barriera epiteliale intestinale, un rivestimento interno spesso una cellula contenente diversi tipi di cellule epiteliali, costituisce la prima barriera fisica difensiva o interfaccia tra l’ambiente esterno e quello interno del corpo ^1,2. Gli enterociti di tipo colonnare costituiscono il tipo più abbondante di cellule epiteliali. Questi sono responsabili del mantenimento dell’integrità della barriera epiteliale attraverso le interazioni tra diversi componenti della barriera, comprese le giunzioni strette (TJ), svolgendo un ruolo significativo nel rafforzamento della barriera ^1,3. La struttura TJ è costituita da proteine della placca intracellulare, come zonula occludens (ZO) e cingulin, che cooperano con proteine transmembrana, tra cui occlusine, claudine e molecole di adesione giunzionale (JAM) che formano una struttura a cerniera che collega strettamente le cellule vicine ^3,4. Le proteine transmembrana regolano la diffusione paracellulare passiva di piccoli composti ed escludono le grandi molecole tossiche.

I composti alimentari potenzialmente tossici e i contaminanti alimentari stimolano la produzione di citochine infiammatorie che interrompono la permeabilità epiteliale, attivando le cellule immunitarie e causando infiammazione cronica dei tessuti intestinali ^5,6,7. Al contrario, è stato riportato che varie sostanze fitochimiche antiossidanti e antinfiammatorie riducono l’espressione delle citochine infiammatorie e migliorano l’integrità della barriera TJ intestinale attraverso il ripristino dell’espressione e dell’assemblaggio della proteina TJ ^4,6,8. Pertanto, la regolazione dell’integrità della barriera epiteliale da parte di composti sia benefici che dannosi ha visto un aumento dell’uso di modelli sia in vivo che in vitro volti a mimare la barriera intestinale per lo screening farmaceutico e gli studi di tossicità. Ciò è particolarmente rilevante dato il crescente interesse per la comprensione della fisiopatologia delle malattie intestinali intestinali (IBD), dell’enterocolite necrotizzante e del cancro, che possono essere simulate nei modelli sperimentali ^8,9,10.

C’è stata una richiesta per lo sviluppo di modelli in vitro basati su cellule al fine di raggiungere l’obiettivo delle “3R” nella sperimentazione animale. Questi includono alternative sostitutive all’uso di animali, riduzione del numero di animali utilizzati e perfezionamento nell’adozione di metodi che alleviano il disagio 11,12,13. Inoltre, i meccanismi molecolari, cellulari e fisiologici sottostanti tra modelli umani e murini (i roditori sono le specie più utilizzate) sono distintivi, portando a controversie sull’efficacia dei modelli murini come predittori nelle risposte umane^12,13. Numerosi vantaggi dei modelli in vitro di linee cellulari umane includono la sperimentazione con target ristretto, l’osservazione diretta e l’analisi continua¹³.

I monostrati di tipo a cellula singola in colture bidimensionali (2D) sono serviti come potenti modelli. Tuttavia, questi non possono riprodurre con precisione la complessità fisiologica dei tessuti umani ^8,13,14. Di conseguenza, i sistemi di coltura 3D vengono sviluppati con miglioramenti sempre crescenti per ricapitolare la complessità fisiologica dei tessuti intestinali sani e malati come strumenti di valutazione del rischio di nuova generazione^13,14. Questi modelli includono scaffold 3D Transwell con diverse linee cellulari, colture di organoidi e dispositivi microfluidici (intestino su chip) che utilizzano sia linee cellulari che organoidi (derivati da tessuti sani e malati)^8,13,14.

Il protocollo intestinale equivalente 3D di “tessuto sano” presentato nel presente studio si basava sul raggiungimento di un equilibrio tra complessità fisiologica e semplicità sperimentale¹³. Il modello è rappresentativo di uno scaffold 3D Transwell, composto da tre linee cellulari (enterociti [la linea di adenocarcinoma del colon Caco-2] con una componente immunitaria di supporto [monociti U937 e fibroblasti L929]), costituenti un sistema standardizzato e facilmente ripetibile applicabile per lo screening preliminare di molecole dietetiche di interesse per l’integrità della barriera epiteliale intestinale e la risposta immunitaria. Il protocollo include l’inclusione della paraffina per la valutazione al microscopio dell’integrità della barriera epiteliale utilizzando equivalenti intestinali fissi. Il vantaggio dell’approccio attuale è che numerose sezioni dei tessuti incorporati possono essere colorate per più parametri da un singolo esperimento.

Protocol

1. Preparazione del modello di base della mucosa intestinale ricostruita in 3D NOTA: L’intera procedura deve essere eseguita in una cappa sterile a flusso laminare. Tutte le fasi della procedura che prevedono l’uso dell’incubatore cellulare implicano l’incubazione delle colture a 37 °C in un’atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 (salvo diversa indicazione nel protocollo). Preparazione preliminare delle linee cellulari utilizzate nel sistema modello inte…

Representative Results

Il primo aspetto importante è quello di determinare l’accettabilità della mucosa intestinale equivalente 3D di base a scopo sperimentale. Questo viene eseguito con il colorante più utilizzato nei laboratori di istologia e istopatologia, ovvero l’ematossilina (colora il materiale nucleare di colore blu-viola intenso) e l’eosina (colora il materiale citoplasmatico di varie tonalità di rosa). La colorazione H&E viene prima eseguita su un controllo non trattato, che viene coltivato nelle stesse condizioni e negli stessi …

Discussion

Il sistema modello di mucosa intestinale ricostruito di base qui presentato (Figura 6) combina la complessità fisiologica (colture cellulari 3D più rilevanti dal punto di vista fisiologico contenenti un monostrato di Caco-2 con un supporto della lamina propria ricco di ECM contenente fibroblasti e monociti) con la semplicità sperimentale (utilizzando linee cellulari umane commerciali per produrre un sistema standardizzato e facilmente ripetibile)¹³. In quanto tale,…