免疫成分を用いた基本的な3次元(3D)腸管モデルシステム
Summary
ここでは、基本的な3次元(3D)腸細胞株モデルシステムの構築と、固定された腸当等物の光学顕微鏡的評価のためのパラフィン包埋プロトコルについて説明します。選択したタンパク質を染色することで、1回の実験で複数の視覚的パラメータを解析し、前臨床薬物スクリーニング研究に活用することができます。
Abstract
炎症性腸疾患の病態生理学の研究、潜在的に有益な物質の薬理学的スクリーニング、および潜在的に有害な食品成分の毒性研究のために、 in vivo および in vitro 腸モデルの使用が増加しています。関連して、動物モデルに代わる細胞ベースの in vitro モデルの開発が現在求められています。ここでは、細胞株を使用した基本的な「健康な組織」の三次元(3D)腸と同等モデルのプロトコルが、実験のシンプルさ(標準化され、容易に再現可能なシステム)と生理学的複雑さ(U937単球とL929線維芽細胞の支持免疫成分を持つCaco-2腸細胞)の両方を提供するという二重の利点を備えています。このプロトコルには、固定腸当量物の光学顕微鏡評価のためのパラフィン包埋も含まれており、それによって1回の実験から複数の視覚パラメータを分析するという利点を提供します。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色した切片は、対照処理でCaco-2柱状細胞がタイトで規則的な単層を形成していることを示すもので、実験システムとしてのモデルの有効性を検証するために使用されます。グルテンを炎症誘発性食品成分として使用し、切片から分析したパラメータには、単層の厚さの減少、基礎となるマトリックス(H&E)からの破壊と剥離、オクルージン染色(統計的に定量化可能)から示されるようなタイトジャンクションタンパク質発現の減少、分化クラスター14(CD14)染色とCD11b関連のマクロファージへの分化から証明される遊走U937細胞の免疫活性化が含まれます。リポ多糖類を用いて腸の炎症をシミュレートすることによって示されるように、測定可能な追加のパラメータは、粘液染色の増加および固定前に培地から抽出することができるサイトカイン発現(ミッドカインなど)である。基本的な3次元(3D)腸粘膜モデルと固定切片は、複数の視覚的に定量化可能なパラメータを分析する可能性を備えた炎症状態とバリアの完全性の研究に推奨できます。
Introduction
腸管上皮関門は、異なる種類の上皮細胞を含む1細胞厚の内層であり、身体の外部環境と内部環境との間の最初の物理的防御障壁または界面を構成する1,2。円柱型腸細胞は、上皮細胞の中で最も豊富なタイプを構成します。これらは、タイトジャンクション(TJ)を含むいくつかのバリアコンポーネント間の相互作用を通じて上皮バリアの完全性を維持する役割を担っており、バリアの引き締めに重要な役割を果たしています1,3。TJ構造は、閉塞帯帯(ZO)やシングリンなどの細胞内プラークタンパク質からなり、オクルージン、クローディン、接合接着分子(JAM)などの膜貫通タンパク質と協働して、隣接する細胞を緊密につなぐジッパー状の構造を形成します3,4。膜貫通型タンパク質は、低分子化合物の受動的な傍細胞拡散を調節し、有毒な高分子を排除します。
潜在的に有毒な食品化合物や食品汚染物質は、炎症性サイトカイン産生を刺激し、上皮透過性を破壊し、免疫細胞を活性化し、慢性的な腸組織の炎症を引き起こします5,6,7。対照的に、さまざまな抗酸化および抗炎症性植物化学物質は、TJタンパク質の発現と組み立ての回復を通じて、炎症性サイトカインの発現を減少させ、腸のTJバリアの完全性を高めることが報告されています4,6,8。したがって、有益な化合物と有害な化合物の両方による上皮バリアの完全性の調節により、医薬品スクリーニングおよび毒性試験のための腸管バリアを模倣することを目的としたin vivoおよびin vitroモデルの両方の使用が増加しています。これは、腸管疾患(IBD)、壊死性腸炎、および癌の病態生理学を理解することへの関心が高まっていることを考えると、特に関連性があります8,9,10。
動物実験における「3R」の目的を達成するために、細胞ベースのin vitroモデルの開発が求められています。これらには、動物の使用に代わる代替手段、使用される動物の数の削減、および苦痛を軽減する方法の採用の改良が含まれます11,12,13。さらに、ヒトモデルとマウスモデル(げっ歯類が最も広く使用されている種)の根底にある分子、細胞、および生理学的メカニズムは独特であり、ヒトの応答における予測因子としてのマウスモデルの有効性に関する論争につながっています12,13。in vitroヒト細胞株モデルの多くの利点には、標的制限実験、直接観察、および連続分析が含まれます13。
2次元(2D)培養における単細胞型単分子膜は、強力なモデルとして役立っています。しかし、これらはヒト組織の生理学的複雑さを正確に再現することはできない8,13,14。その結果、次世代のリスク評価ツールボックスとして、健康な腸組織と病気の腸組織の両方の生理学的複雑さを再現するために、ますます改善された3D培養システムが開発されています13,14。これらのモデルには、多様な細胞株を備えた3Dトランズウェルスキャフォールド、オルガノイド培養物、細胞株とオルガノイド(健康な組織と病気の組織の両方に由来する)の両方を使用したマイクロ流体デバイス(腸管オンチップ)が含まれます8,13,14。
本研究で提示された3D「健康な組織」腸と同等のプロトコルは、生理学的複雑さと実験の単純さのバランスをとることに基づいていました13。このモデルは、3つの細胞株(腸細胞[ゴールドスタンダードの結腸腺癌Caco-2株]と支持免疫成分[U937単球およびL929線維芽細胞])で構成され、腸上皮バリアの完全性と免疫応答に関心のある食物分子の予備スクリーニングに適用可能な標準化された再現性のあるシステムを構成する3Dトランズウェルスキャフォールドの代表例です。プロトコルは固定腸の等量を使用して上皮障壁の完全性の光学顕微鏡評価のためのパラフィンの埋め込みを含んでいる。本アプローチの利点は、1回の実験で複数のパラメータについて、包埋組織の多数の切片を染色することができることである。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する基本的な再建腸粘膜モデルシステム(図6)は、生理学的複雑さ(線維芽細胞と単球を含むECMに富む固有層支持体を持つCaco-2単層を含む、より生理学的に関連性のある3D細胞培養)と実験の単純さ(市販のヒト細胞株を使用して標準化され、再現性のあるシステムを作製する)を兼ね備えています13.そのため、このモデルシステムは、潜在的な医?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ウンベルト・ヴェロネージ財団の研究者活動を支援するフェローシップに感謝します。
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