면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템
Summary
여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.
Abstract
염증성 장 질환의 병태생리학을 연구하고, 잠재적으로 유익한 물질의 약리학적 스크리닝을 위해, 잠재적으로 유해한 식품 성분에 대한 독성 연구를 위해 생체 내 및 체외 장 모델의 사용이 증가하고 있습니다. 관련하여, 동물 모델을 대체하기 위한 세포 기반 in vitro 모델의 개발에 대한 현재 수요가 있습니다. 여기서, 세포주를 사용하는 기본적인 “건강한 조직” 3차원(3D) 장 등가 모델에 대한 프로토콜은 실험적 단순성(표준화되고 쉽게 반복할 수 있는 시스템)과 생리학적 복잡성(U937 단핵구 및 L929 섬유아세포의 지지 면역 구성 요소를 가진 Caco-2 장세포)을 모두 제공하는 두 가지 이점을 제공합니다. 이 프로토콜에는 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩도 포함되어 있어 단일 실험에서 여러 시각적 매개변수를 분석할 수 있는 이점을 제공합니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편은 대조군 처리에서 단단하고 규칙적인 단층을 형성하는 Caco-2 원주 세포를 보여주는 데 사용되어 실험 시스템으로서 모델의 효능을 검증합니다. 글루텐을 전염증성 식품 성분으로 사용하여 단층 두께 감소, 기저 매트릭스(H&E)로부터의 파괴 및 분리, 오클루딘 염색에서 볼 수 있듯이 밀착 접합 단백질 발현 감소(통계적으로 정량화 가능), 분화 14(CD14) 염색 클러스터 및 대식세포로의 CD11b 관련 분화에서 입증된 U937 세포 이동의 면역 활성화가 절편에서 분석된 매개변수가 포함됩니다. 장 염증을 시뮬레이션하기 위해 지질다당류를 사용하여 알 수 있듯이 측정할 수 있는 추가 매개변수는 고정 전에 배지에서 추출할 수 있는 점액 염색 증가 및 사이토카인 발현(예: 미드키네)입니다. 기본적인 3차원(3D) 장 점막 모델 및 고정 절편은 여러 시각적 정량화 가능한 매개변수를 분석할 수 있는 가능성과 함께 염증 상태 및 장벽 무결성 연구에 권장될 수 있습니다.
Introduction
서로 다른 유형의 상피 세포를 포함하는 1 세포 두께의 내부 내막인 장 상피 장벽은 신체의 외부와 내부 환경 사이의 첫 번째 물리적 방어 장벽 또는 인터페이스를 구성합니다 1,2. 원주형 장세포는 가장 풍부한 유형의 상피세포를 구성합니다. 이들은 단단한 접합부(TJ)를 포함한 여러 장벽 구성 요소 간의 상호 작용을 통해 상피 장벽 무결성을 유지하는 역할을 하며, 장벽 강화에 중요한 역할을 합니다 1,3. TJ 구조는 조눌라 오클루덴스(zonula occludens, ZO) 및 싱귤린(cingulin)과 같은 세포내 플라크 단백질로 구성되며, 오클루딘(occludin), 클라우딘(claudin) 및 접합 접착 분자(junctional adhesion molecule, JAM)를 포함한 막관통 단백질과 협력하여 인접 세포를 단단히 연결하는 지퍼 모양의 구조를 형성합니다 3,4. 막관통 단백질은 작은 화합물의 수동 세포주위 확산을 조절하고 독성이 있는 큰 분자를 배제합니다.
잠재적으로 독성이 있는 식품 화합물 및 식품 오염 물질은 상피 투과성을 방해하고 면역 세포를 활성화하며 만성 장 조직 염증을 유발하는 염증성 사이토카인 생성을 자극합니다 5,6,7. 대조적으로, 다양한 항산화 및 항염증 파이토케미컬은 TJ 단백질 발현 및 조립 복원을 통해 염증성 사이토카인 발현을 감소시키고 장내 TJ 장벽 무결성을 향상시키는 것으로 보고되었습니다 4,6,8. 따라서 유익한 화합물과 유해 화합물 모두에 의한 상피 장벽 무결성 조절은 제약 스크리닝 및 독성 연구를 위한 장 장벽을 모방하는 것을 목표로 하는 생체 내 및 시험관 모델 모두의 사용이 증가하는 것을 보았습니다. 이는 장 질환(IBD), 괴사성 장염 및 암의 병태생리학을 이해하는 데 대한 관심이 증가함에 따라 특히 관련이 있으며, 이는 실험 모델8,9,10에서 시뮬레이션할 수 있습니다.
동물 실험에서 “3R”의 목표를 달성하기 위해 세포 기반 in vitro 모델 개발에 대한 요구가 있었습니다. 여기에는 동물 사용에 대한 대체 대안, 사용되는 동물 수의 감소, 고통을 완화하는 방법 채택의 개선이 포함됩니다 11,12,13. 더욱이, 인간과 쥐 모델(설치류가 가장 널리 사용되는 종) 사이의 근본적인 분자, 세포 및 생리학적 메커니즘은 독특하여 인간 반응의 예측 변수로서 쥐 모델의 효능에 대한 논란을 불러일으킨다12,13. in vitro 인간 세포주 모델의 수많은 장점으로는 표적 제한 실험, 직접 관찰 및 연속 분석13이 있습니다.
2차원(2D) 배양에서 단세포형 단층은 강력한 모델 역할을 했습니다. 그러나 이들은 인체 조직의 생리학적 복잡성을 정확하게 재현할 수 없다 8,13,14. 그 결과, 3D 배양 시스템은 건강한 장 조직과 병든 장 조직 모두의 생리학적 복잡성을 차세대 위험 평가 도구 상자로 요약하기 위해 지속적으로 개선되어 개발되고 있습니다13,14. 이러한 모델에는 다양한 세포주를 가진 3D Transwell 스캐폴드, 오가노이드 배양 및 세포주와 오가노이드(건강한 조직과 병든 조직 모두에서 유래)를 모두 사용하는 미세유체 장치(intestine-on-chip)가 포함됩니다8,13,14.
본 연구에서 제시된 3D “건강한 조직” 장 등가 프로토콜은 생리학적 복잡성과 실험적 단순성 사이의 균형을 맞추는 것을 기반으로 했다13. 이 모델은 3개의 세포주(면역 성분[U937 단핵구 및 L929 섬유아세포]가 있는 장세포[대장 선암종 Caco-2 계열])로 구성된 3D Transwell 스캐폴드를 대표하며, 장 상피 장벽 무결성 및 면역 반응에 대한 관심 식이 분자의 예비 스크리닝에 적용할 수 있는 표준화되고 쉽게 반복 가능한 시스템을 구성합니다. 이 프로토콜에는 고정 장 등가물을 사용하여 상피 장벽 무결성의 광현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩이 포함됩니다. 현재 접근법의 장점은 단일 실험에서 여러 매개변수에 대해 묻힌 조직의 수많은 섹션을 염색할 수 있다는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 기본 재구성 장 점막 모델 시스템(그림 6)은 생리학적 복잡성(섬유아세포 및 단핵구를 포함하는 ECM이 풍부한 lamina propria 지지체와 함께 Caco-2 단층을 포함하는 생리학적으로 더 관련성이 높은 3D 세포 배양)과 실험적 단순성(표준화되고 쉽게 반복 가능한 시스템을 생산하기 위해 상업용 인간 세포주를 사용)을 결합합니다.13. 따라서 이 모델 시?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구자 작업을 지원하는 펠로우십을 제공한 움베르토 베로네시 재단(Umberto Veronesi Foundation)에 감사드립니다.
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