Grundlæggende tredimensionelt (3D) tarmmodelsystem med en immunkomponent

Summary

Her beskriver vi konstruktionen af et grundlæggende tredimensionelt (3D) tarmcellelinjemodelsystem og en paraffinindlejringsprotokol til lysmikroskopisk evaluering af faste tarmækvivalenter. Farvning af udvalgte proteiner tillader analyse af flere visuelle parametre fra et enkelt eksperiment til potentiel anvendelse i prækliniske lægemiddelscreeningsundersøgelser.

Abstract

Der har været en stigning i brugen af in vivo – og in vitro-tarmmodeller til undersøgelse af patofysiologien af inflammatoriske tarmsygdomme, til farmakologisk screening af potentielt gavnlige stoffer og til toksicitetsundersøgelser af potentielt skadelige levnedsmiddelkomponenter. Af relevans er der en aktuel efterspørgsel efter udvikling af cellebaserede in vitro-modeller til erstatning af dyremodeller. Her præsenteres en protokol for en grundlæggende, “sundt væv” tredimensionel (3D) tarmækvivalent model ved hjælp af cellelinjer med den dobbelte fordel at give både eksperimentel enkelhed (standardiseret og let gentageligt system) og fysiologisk kompleksitet (Caco-2 enterocytter med en understøttende immunkomponent af U937 monocytter og L929 fibroblaster). Protokollen inkluderer også paraffinindlejring til lysmikroskopisk evaluering af faste tarmækvivalenter, hvilket giver fordelen ved at analysere flere visuelle parametre fra et enkelt eksperiment. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvede sektioner, der viser Caco-2 søjleformede celler, der danner et tæt og regelmæssigt monolag i kontrolbehandlinger, bruges til at verificere effektiviteten af modellen som et eksperimentelt system. Ved anvendelse af gluten som en proinflammatorisk fødevarekomponent inkluderer parametre analyseret fra sektioner reduceret monolagtykkelse samt forstyrrelse og løsrivelse fra den underliggende matrix (H&E), nedsat tæt forbindelsesproteinekspression som vist ved okklusionfarvning (kvantificerbar statistisk) og immunaktivering af migrerende U937-celler som det fremgår af klyngen af differentiering 14 (CD14) farvning og CD11b-relateret differentiering i makrofager. Som vist ved at bruge lipopolysaccharid til at simulere tarmbetændelse, er yderligere parametre, der kan måles, øget slimfarvning og cytokinekspression (såsom midkin), der kan ekstraheres fra mediet før fiksering. Den grundlæggende tredimensionelle (3D) tarmslimhindemodel og faste sektioner kan anbefales til inflammatoriske status- og barriereintegritetsundersøgelser med mulighed for at analysere flere visuelle kvantificerbare parametre.

Introduction

Den intestinale epitelbarriere, en encelle tyk indre foring, der indeholder forskellige typer epitelceller, udgør den første fysiske defensive barriere eller grænseflade mellem ydersiden og det indre miljø i kroppen ^1,2. Enterocytter af kolonnetype udgør den mest rigelige type epitelceller. Disse er ansvarlige for at opretholde epitelbarriereintegritet gennem interaktioner mellem flere barrierekomponenter, herunder stramme kryds (TJ’er), der spiller en væsentlig rolle i barrierestramning ^1,3. TJ-strukturen består af intracellulære plakproteiner, såsom zonula occludens (ZO) og cingulin, der samarbejder med transmembranproteiner, herunder occludiner, claudiner og junctional adhæsion molekyler (JAM’er), der danner lynlåslignende struktur, der tæt forbinder nabocellerne ^3,4. De transmembranproteiner regulerer den passive paracellulære diffusion af små forbindelser og udelukker giftige store molekyler.

Potentielt giftige fødevareforbindelser og fødevareforurenende stoffer stimulerer inflammatorisk cytokinproduktion, der forstyrrer epitelpermeabiliteten, aktiverer immunceller og forårsager kronisk tarmvævsbetændelse ^5,6,7. I modsætning hertil er forskellige antioxidant- og antiinflammatoriske fytokemikalier blevet rapporteret at reducere inflammatorisk cytokinekspression og forbedre tarm-TJ-barriereintegriteten gennem genoprettelse af TJ-proteinekspression og samling ^4,6,8. Derfor har reguleringen af epitelbarrierens integritet af både gavnlige og skadelige forbindelser set en stigning i brugen af både in vivo– og in vitro-modeller, der sigter mod at efterligne tarmbarrieren til farmaceutisk screening og toksicitetsundersøgelser. Dette er især relevant i betragtning af den stigende interesse for at forstå patofysiologien af tarmsygdomme (IBD), nekrotiserende enterocolitis og kræft, som kan simuleres i eksperimentelle modeller ^8,9,10.

Der har været efterspørgsel efter udvikling af cellebaserede in vitro-modeller for at nå målet om “3R’erne” i dyreforsøg. Disse omfatter erstatningsalternativer til brugen af dyr, reduktion i antallet af anvendte dyr og forfining i vedtagelsen af metoder, der lindrer nød 11,12,13. Desuden er de underliggende molekylære, cellulære og fysiologiske mekanismer mellem humane og murinmodeller (gnavere er den mest anvendte art) karakteristiske, hvilket fører til kontroverser om effektiviteten af murine modeller som prædiktorer i humane reaktioner^12,13. Talrige fordele ved in vitro humane cellelinjemodeller omfatter målbegrænsede eksperimenter, direkte observation og kontinuerlig analyse¹³.

Enkeltcelle-type monolag i todimensionelle (2D) kulturer har fungeret som kraftfulde modeller. Disse kan imidlertid ikke præcist reproducere den fysiologiske kompleksitet af humant væv ^8,13,14. Som følge heraf udvikles 3D-kultursystemer med stadigt stigende forbedringer for at rekapitulere den fysiologiske kompleksitet af både sundt og sygt tarmvæv som næste generations risikovurderingsværktøjskasser^13,14. Disse modeller inkluderer 3D Transwell-stilladser med forskellige cellelinjer, organoidkulturer og mikrofluidiske enheder (tarm-på-chip) ved hjælp af både cellelinjer og organoider (afledt af både sunde og syge væv)^8,13,14.

3D “sundt væv” intestinal ækvivalent protokol præsenteret i denne undersøgelse var baseret på at finde en balance mellem fysiologisk kompleksitet og eksperimentel enkelhed¹³. Modellen er repræsentativ for et 3D Transwell-stillads, der består af tre cellelinjer (enterocytter [guldstandarden colon adenocarcinoma Caco-2-linje] med en understøttende immunkomponent [U937-monocytter og L929-fibroblaster]), der udgør et standardiseret og let gentageligt system, der kan anvendes til foreløbig screening af diætmolekyler af interesse for intestinal epitelbarriereintegritet og immunrespons. Protokollen inkluderer paraffinindlejring til lysmikroskopisk evaluering af epitelbarriereintegritet ved anvendelse af faste tarmækvivalenter. Fordelen ved den nuværende fremgangsmåde er, at adskillige sektioner af de indlejrede væv kan gøres til farvning for flere parametre fra et enkelt eksperiment.

Protocol

1. Udarbejdelse af den grundlæggende 3D rekonstruerede tarmslimhindemodel BEMÆRK: Hele proceduren skal udføres i en steril laminar strømningshætte. Alle trin i proceduren, der involverer anvendelse af celleinkubatoren, betyder, at kulturer inkuberes ved 37 °C i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2 (medmindre andet er angivet i protokollen). Forudgående forberedelse af cellelinjerne anvendt i tarmmodelsystemetSeed L929 musefibroblastceller i …

Representative Results

Det første vigtige aspekt er at bestemme acceptabiliteten af den grundlæggende 3D intestinale ækvivalente slimhinde til eksperimentelle formål. Dette udføres med den mest anvendte plet i histologi- og histopatologilaboratorier, nemlig hæmatoxylin (pletter nukleart materiale dyb blålilla farve) og eosin (pletter cytoplasmatisk materiale varierende nuancer af pink). H&E-farvningen udføres først på en ubehandlet kontrol, som dyrkes under samme forhold og tidsramme som de eksperimentelle behandlinger. Fra visualise…

Discussion

Det grundlæggende rekonstruerede tarmslimhindemodelsystem, der præsenteres her (figur 6), kombinerer fysiologisk kompleksitet (mere fysiologisk relevante 3D-cellekulturer indeholdende et Caco-2-monolag med en ECM-rig lamina propria-støtte indeholdende fibroblaster og monocytter) med eksperimentel enkelhed (ved hjælp af kommercielle humane cellelinjer til fremstilling af standardiseret og let gentageligt system)¹³. Som sådan anses dette modelsystem for at være et…