एक प्रतिरक्षा घटक के साथ बुनियादी तीन आयामी (3 डी) आंतों के मॉडल प्रणाली
Summary
यहां हम एक बुनियादी त्रि-आयामी (3 डी) आंतों की सेल लाइन मॉडल प्रणाली और निश्चित आंतों के समकक्षों के प्रकाश सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए एक पैराफिन एम्बेडिंग प्रोटोकॉल के निर्माण का वर्णन करते हैं। चयनित प्रोटीन के धुंधला preclinical दवा स्क्रीनिंग अध्ययन में संभावित उपयोग के लिए एक ही प्रयोग से कई दृश्य मापदंडों के विश्लेषण की अनुमति देता है.
Abstract
भड़काऊ आंतों के रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए विवो और इन विट्रो आंतों के मॉडल के उपयोग में वृद्धि हुई है, संभावित लाभकारी पदार्थों की औषधीय जांच के लिए, और संभावित हानिकारक खाद्य घटकों पर विषाक्तता अध्ययन के लिए। प्रासंगिकता की, पशु मॉडल को प्रतिस्थापित करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सेल आधारित के विकास के लिए एक वर्तमान मांग है. यहां, सेल लाइनों का उपयोग करके एक बुनियादी, “स्वस्थ ऊतक” त्रि-आयामी (3 डी) आंतों के समकक्ष मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक सादगी (मानकीकृत और आसानी से दोहराने योग्य प्रणाली) और शारीरिक जटिलता (कैको -2 एंटरोसाइट्स यू 937 मोनोसाइट्स और एल 929 फाइब्रोब्लास्ट के सहायक प्रतिरक्षा घटक के साथ) प्रदान करने के दोहरे लाभ के साथ प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल भी निश्चित आंतों समकक्षों के प्रकाश सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए पैराफिन एम्बेडिंग भी शामिल है, जिससे एक ही प्रयोग से कई दृश्य मापदंडों का विश्लेषण करने का लाभ प्रदान करते हैं। हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) सना हुआ खंड जो नियंत्रण उपचार में एक तंग और नियमित मोनोलेयर बनाने वाले काको -2 स्तंभ कोशिकाओं को दिखाते हैं, एक प्रयोगात्मक प्रणाली के रूप में मॉडल की प्रभावकारिता को सत्यापित करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक समर्थक भड़काऊ खाद्य घटक के रूप में लस का प्रयोग, वर्गों से विश्लेषण मापदंडों कम monolayer मोटाई, साथ ही साथ बाधा और अंतर्निहित मैट्रिक्स (एच एंड ई) से टुकड़ी शामिल हैं, तंग जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति में कमी के रूप में occludin धुंधला (quantifiable सांख्यिकीय रूप से) से दिखाया गया है, और प्रतिरक्षा-सक्रियण U937 कोशिकाओं पलायन के रूप में भेदभाव 14 (CD14) धुंधला और मैक्रोफेज में CD11b से संबंधित भेदभाव के क्लस्टर से सबूत के रूप में. जैसा कि आंतों की सूजन का अनुकरण करने के लिए लिपोपॉलेसेकेराइड का उपयोग करके दिखाया गया है, अतिरिक्त पैरामीटर जिन्हें मापा जा सकता है, वे हैं बलगम धुंधला हो जाना और साइटोकिन अभिव्यक्ति (जैसे मिडकिन) में वृद्धि हुई है जिसे निर्धारण से पहले माध्यम से निकाला जा सकता है। बुनियादी त्रि-आयामी (3 डी) आंतों के श्लेष्म मॉडल और निश्चित वर्गों को कई दृश्य मात्रात्मक मापदंडों का विश्लेषण करने की संभावना के साथ भड़काऊ स्थिति और बाधा अखंडता अध्ययन के लिए अनुशंसित किया जा सकता है।
Introduction
आंतों के उपकला बाधा, एक कोशिका-मोटी आंतरिक अस्तर जिसमें विभिन्न प्रकार की उपकला कोशिकाएं होती हैं, शरीर के बाहर और आंतरिक परिवेश 1,2 के बीच पहली शारीरिक रक्षात्मक बाधा या इंटरफ़ेस का गठन करती है। स्तंभ-प्रकार के एंटरोसाइट्स उपकला कोशिकाओं के सबसे प्रचुर प्रकार का गठन करते हैं। ये तंग जंक्शनों (टीजे) सहित कई बाधा घटकों के बीच बातचीत के माध्यम से उपकला बाधा अखंडता को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार हैं, जो बाधाकसने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं 1,3. टीजे संरचना में इंट्रासेल्युलर पट्टिका प्रोटीन होते हैं, जैसे ज़ोनुला ऑक्लुडेंस (जेडओ) और सिंगुलिन, ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के साथ सहयोग करते हैं, जिसमें ऑक्लुडिन, क्लॉडिन और जंक्शनल आसंजन अणु (जेएएम) शामिल हैं जो जिपर जैसी संरचना बनाते हैं जो पड़ोसी कोशिकाओंको 3,4 से जोड़ते हैं। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन छोटे यौगिकों के निष्क्रिय पैरासेल्युलर प्रसार को नियंत्रित करते हैं और जहरीले बड़े अणुओं को बाहर करते हैं।
संभावित विषाक्त खाद्य यौगिकों और खाद्य संदूषक भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन को उत्तेजित करते हैं जो उपकला पारगम्यता को बाधित करता है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सक्रिय करता है और पुरानी आंतों के ऊतकों की सूजन 5,6,7का कारण बनता है। इसके विपरीत, विभिन्न एंटी-ऑक्सीडेंट और एंटी-इंफ्लेमेटरी फाइटोकेमिकल्स को भड़काऊ साइटोकिन अभिव्यक्ति को कम करने और टीजे प्रोटीन अभिव्यक्ति और असेंबली 4,6,8की बहाली के माध्यम से आंतों के टीजे बाधा अखंडता को बढ़ाने के लिए सूचित किया गया है। इसलिए, लाभकारी और हानिकारक दोनों यौगिकों द्वारा उपकला बाधा अखंडता के विनियमन ने दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता अध्ययन के लिए आंतों की बाधा की नकल करने के उद्देश्य से विवो और इन विट्रो मॉडल दोनों के उपयोग में वृद्धि देखी है। यह विशेष रूप से आंतों के आंत्र रोगों (आईबीडी), नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस और कैंसर के पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने में बढ़ती रुचि को देखते हुए प्रासंगिक है, जिसे प्रयोगात्मक मॉडल 8,9,10में अनुकरण किया जा सकता है।
पशु परीक्षण में “3 आर” के उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सेल आधारित के विकास की मांग की गई है। इनमें जानवरों के उपयोग के प्रतिस्थापन विकल्प, उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या में कमी और संकट को कम करने वाले तरीकों को अपनाने में शोधन 11,12,13 शामिल हैं। इसके अलावा, मानव और murine मॉडल (कृन्तकों सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रजातियों जा रहा है) के बीच अंतर्निहित आणविक, सेलुलर, और शारीरिक तंत्र मानव प्रतिक्रियाओं12,13 में भविष्यवक्ताओं के रूप में murine मॉडल की प्रभावकारिता के बारे में विवाद के लिए अग्रणी, विशिष्ट हैं. इन विट्रो मानव सेल लाइन मॉडल में के कई फायदे लक्ष्य प्रतिबंधित प्रयोग, प्रत्यक्ष अवलोकन, और निरंतर विश्लेषण13 शामिल हैं.
द्वि-आयामी (2 डी) संस्कृतियों में एकल-सेल-प्रकार मोनोलेयर ने शक्तिशाली मॉडल के रूप में कार्य किया है। हालांकि, ये मानव ऊतकों 8,13,14 की शारीरिक जटिलता को ठीक से पुन: पेश नहीं कर सकते हैं। नतीजतन, 3 डी संस्कृति प्रणालियों अगली पीढ़ी के जोखिम मूल्यांकन टूलबॉक्स13,14 के रूप में स्वस्थ और रोगग्रस्त आंतों के ऊतकों दोनों की शारीरिक जटिलता recapitulate करने के लिए कभी बढ़ती सुधार के साथ विकसित किया जा रहा है. इन मॉडलों में सेल लाइनों और ऑर्गेनोइड (स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों दोनों से व्युत्पन्न)8,13,14का उपयोग करके विविध सेल लाइनों, ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों (आंत-ऑन-चिप) के साथ 3 डी ट्रांसवेल मचान शामिल हैं।
वर्तमान अध्ययन में प्रस्तुत 3 डी “स्वस्थ ऊतक” आंतों समकक्ष प्रोटोकॉल शारीरिक जटिलता और प्रयोगात्मक सादगी13 के बीच संतुलन बनाने पर आधारित था. मॉडल एक 3 डी ट्रांसवेल मचान का प्रतिनिधि है, जिसमें तीन सेल लाइनें (एंटरोसाइट्स [गोल्ड-स्टैंडर्ड कोलन एडेनोकार्सिनोमा कैको -2 लाइन] एक सहायक प्रतिरक्षा घटक [यू 937 मोनोसाइट्स और एल 929 फाइब्रोब्लास्ट्स] के साथ) शामिल हैं, जो आंतों के उपकला बाधा अखंडता और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर ब्याज के आहार अणुओं की प्रारंभिक जांच के लिए लागू एक मानकीकृत और आसानी से दोहराने योग्य प्रणाली का गठन करते हैं। प्रोटोकॉल निश्चित आंतों समकक्षों का उपयोग कर उपकला बाधा अखंडता के प्रकाश सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए पैराफिन एम्बेडिंग भी शामिल है. वर्तमान दृष्टिकोण का लाभ यह है कि एम्बेडेड ऊतकों के कई वर्गों को एक ही प्रयोग से कई मापदंडों के लिए दाग करने के लिए बनाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
बुनियादी पुनर्निर्मित आंतों के श्लेष्म मॉडल प्रणाली यहाँ प्रस्तुत (चित्रा 6) प्रयोगात्मक सादगी के साथ शारीरिक जटिलता (अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक 3 डी सेल संस्कृतियों एक ईसीएम अमीर लामिन…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
शोधकर्ता के काम का समर्थन करने वाली फैलोशिप के लिए अम्बर्टो वेरोनेसी फाउंडेशन के लिए धन्यवाद।
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