Yoğunluk Gradyanlı Santrifüj Kullanılarak İnsan Dışkısından Bakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Saflaştırılması
Summary
Bu çalışma, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) yoluyla insan dışkısından zenginleştirilmiş bakteriyel hücre dışı vezikülleri (BEV’ler) izole etmek ve saflaştırmak için bir yöntemi açıklamakta, BEV’lerin fiziksel özelliklerini morfoloji, partikül boyutu ve konsantrasyondan tanımlamakta ve DGC yaklaşımının klinik ve bilimsel araştırmalardaki potansiyel uygulamalarını tartışmaktadır.
Abstract
Bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV’ler), ana bakterilerden miras alınan proteinler, lipitler ve nükleik asitler gibi biyoaktif molekülleri aktaran, bakteri-bakteri ve bakteri-konakçı iletişiminde aktif rol oynayan bakterilerden türetilen nanoveziküllerdir. Bağırsak mikrobiyotasından türetilen BEV’lerin gastrointestinal sistem içinde etkileri vardır ve uzak organlara ulaşabilir, bu da fizyoloji ve patoloji için önemli etkilere neden olur. İnsan dışkısından elde edilen BEV’lerin türlerini, miktarlarını ve rollerini araştıran teorik araştırmalar, bağırsak mikrobiyotasından BEV’lerin salgılanmasını ve işlevini anlamak için çok önemlidir. Bu araştırmalar aynı zamanda BEV’leri izole etmek ve saflaştırmak için mevcut stratejide bir iyileştirme gerektirmektedir.
Bu çalışma, iki yoğunluk gradyanlı santrifüj (DGC) modu oluşturarak BEV’lerin izolasyon ve saflaştırma sürecini optimize etti: Yukarıdan aşağıya ve Aşağıdan yukarıya. BEV’lerin zenginleştirilmiş dağılımı 6 ila 8 (F6-F8) fraksiyonlarında belirlendi. Yaklaşımın etkinliği, partikül morfolojisi, boyutu, konsantrasyonu ve protein içeriğine göre değerlendirildi. Partikül ve protein geri kazanım oranları hesaplandı ve iki DGC modunun geri kazanımını ve saflığını karşılaştırmak için spesifik belirteçlerin varlığı analiz edildi. Sonuçlar, Yukarıdan aşağıya santrifüj modunun daha düşük kontaminasyon seviyelerine sahip olduğunu ve Aşağıdan yukarıya modelinkine benzer bir geri kazanım oranı ve saflığa ulaştığını gösterdi. 108 / mg’lık bir fekal BEV konsantrasyonu elde etmek için 7 saatlik bir santrifüj süresi yeterliydi.
Bu yöntem, dışkı dışında, bileşenlerdeki ve viskozitedeki farklılıklara göre uygun modifikasyonla diğer vücut sıvısı tiplerine de uygulanabilir. Sonuç olarak, bu ayrıntılı ve güvenilir protokol, BEV’lerin standartlaştırılmış izolasyonunu ve saflaştırılmasını kolaylaştıracak ve böylece sonraki multi-omik analiz ve fonksiyonel deneyler için bir temel oluşturacaktır.
Introduction
Bağırsak, insan vücudunda en bol bulunan mikrobiyal toplulukları barındıran organ olarak kabul edilmektedir ve bakterilerin %90’ından fazlası kolonizasyon ve çoğalmadarol oynar 1,2. Kapsamlı kanıtlar, bağırsak mikrobiyotasının bağırsak mikroçevresini modüle ettiğini ve aynı zamanda, öncelikle bozulmuş bir bağırsak bariyeri 3,4 yoluyla uzak organlardaki işlev bozukluğu ile etkileşime girdiğini göstermiştir. Artan kanıtlar, bağırsak mikrobiyotasının dengesizliği ile inflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) ilerlemesi arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir5,6 ve ayrıca bağırsak-beyin ekseni 5,6,7,8 yoluyla bilişsel bozukluklar. Bakteriler tarafından üretilen bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV’ler) bu patolojik süreçlerde önemli rol oynar.
BEV’ler, çapları 20 ila 400 nm arasında değişen, bakteri türevlerini kapsülleyen nano ölçekli parçacıklardır. Bakteriler ve konakçı organizmalar arasındaki etkileşimleri kolaylaştırdıkları gösterilmiştir 9,10. Görünmez olmalarına rağmen, bu parçacıklar, tanısal biyobelirteçler, terapötik hedefler ve ilaç dağıtım araçları olarak ileriye dönük geniş uygulamaları nedeniyle araştırmacıların artan ilgisini çekmiştir11. Ağırlıklı olarak bağırsak bakterilerinden elde edilen BEV’leri incelemek için genellikle biyonumune olarak kullanılan insan dışkısı, diğerleri arasında su, bakteri, lipitler, proteinler, sindirilmemiş gıda artıkları ve pul pul dökülmüş epitel hücrelerinin karmaşık bir karışımını içerir. Karmaşık dışkı bileşimi, BEV’lerin izolasyonu ve saflığı için zorluklar yaratır ve böylece BEV’lerin kapsamlı, objektif ve gerçekçi bir analizini engeller. Bu nedenle, kirletici bileşenlerden kaynaklanan paraziti en aza indirmek ve BEV’lerin verimini artırmak için etkili stratejiler, derhal ilgilenilmesi gereken kritik konular olarak ortaya çıkmıştır.
Mevcut izolasyon stratejileri büyük ölçüde ultra yüksek hızlı santrifüjleme (UC), yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) gibi tekniklere dayanmaktadır12,13,14,15,16,17. Şu anda DGC, numunenin ilk yükleme konumu tarafından belirlenen “Yukarıdan aşağıya” ve “Aşağıdan yukarıya” olmak üzere iki sedimantasyon-yüzer modu kapsayan, BEV ayırma alanında en yaygın olarak uygulanan yöntemlerden biridir. Bu metodolojiler, hücre dışı vezikülleri (EV’ler) boyut ve yoğunluk eşitsizliklerine dayalı olarak diğer bileşenlerden ayırarak değişken saflık ve geri kazanım oranları sağlar. Önceki araştırmalar, EV’leri kandakilipoprotein 18 ve idrardaki Tamm-Horsfall proteini19 gibi vücut sıvısı örneklerinde çözünür proteinlerden yeterince ayırmak için tek yaklaşımlı stratejilerin yetersiz olduğunu göstermiştir. Ek olarak, ökaryotik hücre dışı veziküllerin (EEV’ler) boyut dağılımı genellikle BEV’lerinkiyle örtüşür ve bu nedenle BEV verimini optimize etmek için daha fazla metodolojik geliştirme gerektirir. Sonuç olarak, BEV’lerin çalışmasını ilerletmek, etkili ayırma ve saflaştırma metodolojilerinin geliştirilmesine bağlıdır. Özellikle, Tulkens ve ark.15, fekal BEV’leri EEV’lerden ayırmak için ortogonal bir biyofiziksel strateji kullandılar, burada Aşağıdan yukarıya DGC modunun santrifüjleme süresi 18 saate kadardı. Buna karşılık, bu çalışma bunu 7 saate düşürdü, gradyan-ultrasantrifüj süresinden büyük ölçüde tasarruf sağladı ve süreci basitleştirdi.
Bu çalışmada, BEV’leri düşükten aşırı yüksek hıza kadar bir dizi diferansiyel santrifüj hızıyla zenginleştirdikten sonra, optimize edilmiş tampon koşulları altında iki DGC modu kullanan fekal BEV’leri izole ettik ve saflaştırdık. Morfolojiye, partikül boyutuna ve konsantrasyona dayalı değerlendirmeler, bu gelişmiş yöntemle övgüye değer bir performans gösterdi. Bu çalışma, gelecekteki araştırmalar için temel oluşturabilir, uygulamalarını daha geniş bir alana genişletebilir ve insan vücudundaki BEV’lerin heterojenliği hakkında fikir verebilir. Ayrıca BEV ayırma ve analiz tekniklerinin standardizasyonuna da katkıda bulunur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriyel hücre dışı veziküller (BEV’ler), bakteriler tarafından salgılanan, çok sayıda protein, lipit, nükleik asit ve diğer biyoaktif molekülleri taşıyan, bakterilerin fonksiyonel etkilerine aracılık etmeye katkıda bulunan lipid-çift katmanlı nanopartiküllerdir20. Bağırsaktan elde edilen BEV’lerin inflamatuar bağırsak hastalığı, Crohn hastalığı ve kolorektal kanser gibi hastalıkların gelişiminde rol oynadığı ve ayrıca genel metabolizmayı etkilediği ve bozu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’nın (82230080) Anahtar projesi olan Seçkin Genç Akademisyenler için Ulusal Bilim Fonu (82025024) tarafından desteklenmiştir;Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2021YFA1300604); Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81871735, 82272438 ve 82002245); Seçkin Genç Akademisyenler için Guangdong Doğa Bilimleri Fonu (2023B1515020058); Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2021A1515011639); Çin’deki Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı’nın Büyük Devlet Temel Araştırma Geliştirme Programı (ZR2020ZD11); Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2022M720059); Güney Tıp Üniversitesi, Nanfang Hastanesi’nin Üstün Gençlik Geliştirme Programı (2022J001).
Materials
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
Riferimenti
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
