Deze studie beschrijft een methode om bacteriële extracellulaire vesikels (BEV’s) verrijkt uit menselijke uitwerpselen te isoleren en te zuiveren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), identificeert de fysieke kenmerken van BEV’s op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie, en bespreekt de mogelijke toepassingen van de DGC-benadering in klinisch en wetenschappelijk onderzoek.
Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV’s) zijn nanoblaasjes die zijn afgeleid van bacteriën die een actieve rol spelen in de communicatie tussen bacteriën en bacteriën, waarbij bioactieve moleculen zoals eiwitten, lipiden en nucleïnezuren worden overgedragen die zijn geërfd van de ouderbacteriën. BEV’s afgeleid van de darmmicrobiota hebben effecten in het maagdarmkanaal en kunnen verre organen bereiken, wat resulteert in aanzienlijke implicaties voor fysiologie en pathologie. Theoretisch onderzoek naar de soorten, hoeveelheden en rollen van BEV’s afkomstig van menselijke uitwerpselen is cruciaal voor het begrijpen van de afscheiding en functie van BEV’s uit de darmmicrobiota. Deze onderzoeken vereisen ook een verbetering van de huidige strategie voor het isoleren en zuiveren van BEV’s.
Deze studie optimaliseerde het isolatie- en zuiveringsproces van BEV’s door twee dichtheidsgradiëntcentrifugatiemodi (DGC) vast te stellen: Top-down en Bottom-up. De verrijkte verdeling van BEV’s werd bepaald in fracties 6 tot en met 8 (F6-F8). De effectiviteit van de aanpak werd geëvalueerd op basis van deeltjesmorfologie, grootte, concentratie en eiwitgehalte. De terugwinningspercentages van deeltjes en eiwitten werden berekend en de aanwezigheid van specifieke markers werd geanalyseerd om het herstel en de zuiverheid van de twee DGC-modi te vergelijken. De resultaten gaven aan dat de top-down centrifugatiemodus lagere verontreinigingsniveaus had en een terugwinningspercentage en zuiverheid bereikte die vergelijkbaar waren met die van de bottom-upmodus. Een centrifugatietijd van 7 uur was voldoende om een fecale BEV-concentratie van 108/mg te bereiken.
Afgezien van uitwerpselen, kan deze methode worden toegepast op andere soorten lichaamsvloeistoffen met de juiste modificatie volgens de verschillen in componenten en viscositeit. Concluderend kan worden gesteld dat dit gedetailleerde en betrouwbare protocol de gestandaardiseerde isolatie en zuivering van BEV’s zou vergemakkelijken en zo een basis zou leggen voor latere multi-omics-analyse en functionele experimenten.
De darm wordt algemeen erkend als het orgaan dat de meest voorkomende microbiële gemeenschappen in het menselijk lichaam herbergt, met meer dan 90% van de bacteriën die betrokken zijn bij kolonisatie en vermenigvuldiging 1,2. Uitgebreid bewijs heeft aangetoond dat de darmmicrobiota de darmmicro-omgeving moduleert en tegelijkertijd interageert met disfunctie in verre organen, voornamelijk via een verminderde darmbarrière 3,4. Toenemend bewijs wijst op een correlatie tussen de onbalans van de darmmicrobiota en de progressie van inflammatoire darmaandoeningen (IBD)5,6, evenals cognitieve stoornissen via de darm-hersenas 5,6,7,8. Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV’s) geproduceerd door bacteriën spelen een belangrijke rol in deze pathologische processen.
BEV’s zijn deeltjes op nanoschaal die bacteriële derivaten inkapselen, met diameters variërend van 20 tot 400 nm. Van hen is aangetoond dat ze interacties tussen bacteriën en hun gastheerorganismen vergemakkelijken 9,10. Ondanks hun onzichtbaarheid hebben deze deeltjes steeds meer aandacht gekregen van onderzoekers vanwege hun toekomstige brede toepassingen als diagnostische biomarkers, therapeutische doelen en voertuigen voor medicijnafgifte. Menselijke uitwerpselen, vaak gebruikt als biospecimens voor het bestuderen van BEV’s, voornamelijk afkomstig van darmbacteriën, bevatten een complex mengsel van onder andere water, bacteriën, lipiden, eiwitten, onverteerde voedselresten en geëxfolieerde epitheelcellen. De ingewikkelde fecale samenstelling vormt een uitdaging voor de isolatie en zuiverheid van BEV’s, waardoor een uitgebreide, objectieve en realistische analyse van BEV’s wordt belemmerd. Vandaar dat effectieve strategieën om interferentie door verontreinigende componenten te minimaliseren en de opbrengst van BEV’s te verbeteren, naar voren zijn gekomen als kritieke problemen die onmiddellijke aandacht verdienen.
Bestaande isolatiestrategieën zijn grotendeels gebaseerd op technieken zoals ultrasnelle centrifugatie (UC), dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC) en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)12,13,14,15,16,17. Momenteel is DGC een van de meest toegepaste methoden op het gebied van BEV-scheiding, die twee sedimentatie-zwevende modi omvat, “Top-down” en “Bottom-up”, die worden bepaald door de initiële laadpositie van het monster. Deze methodologieën onderscheiden extracellulaire vesikels (EV’s) van andere componenten op basis van verschillen in grootte en dichtheid, wat variabele zuiverheid en terugwinningspercentages oplevert. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat enkelvoudige benaderingsstrategieën onvoldoende zijn om EV’s adequaat te scheiden van oplosbare eiwitten in lichaamsvloeistofmonsters, zoals lipoproteïne in bloed18 en Tamm-Horsfall-eiwit in urine19. Bovendien overlapt de grootteverdeling van eukaryote extracellulaire vesikels (EEV’s) vaak met die van BEV’s, waardoor verdere methodologische verbeteringen nodig zijn om de BEV-opbrengst te optimaliseren. Bijgevolg hangt het bevorderen van de studie van BEV’s af van de ontwikkeling van effectieve scheidings- en zuiveringsmethoden. Met name Tulkens et al 15 gebruikten een orthogonale biofysische strategie om fecale BEV’s te scheiden van EEV’s, waarbij de centrifugatietijd van een bottom-up DGC-modus maximaal18 uur was. Deze studie daarentegen heeft het teruggebracht tot 7 uur, waardoor de gradiënt-ultracentrifugatietijd aanzienlijk werd bespaard en het proces werd vereenvoudigd.
In de huidige studie hebben we fecale BEV’s geïsoleerd en gezuiverd met behulp van twee DGC-modi onder geoptimaliseerde bufferomstandigheden, na BEV’s te hebben verrijkt met een reeks differentiële centrifugatiesnelheden, van lage tot extreem hoge snelheid. Evaluaties op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie wezen op een lovenswaardige prestatie van deze verbeterde methode. Deze studie zou als basis kunnen dienen voor toekomstig onderzoek, waarbij de toepassingen ervan worden uitgebreid naar een breder domein en inzicht wordt geboden in de heterogeniteit van BEV’s binnen het menselijk lichaam. Het draagt ook bij aan de standaardisatie van BEV-scheidings- en analysetechnieken.
Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV’s) zijn lipide-dubbellaagse nanodeeltjes die door bacteriën worden uitgescheiden en een schat aan eiwitten, lipiden, nucleïnezuren en andere bioactieve moleculen bevatten, die bijdragen aan het mediëren van de functionele effecten van bacteriën20. Van BEV’s afkomstig van de darm is geverifieerd dat ze betrokken zijn bij de ontwikkeling van ziekten, zoals inflammatoire darmaandoeningen, de ziekte van Crohn en colorectale kanker, en ook het algemene meta…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); het Key-project van de National Natural Science Foundation of China (82230080); het National Key R&D-programma van China (2021YFA1300604); de National Natural Science Foundation of China (81871735, 82272438 en 82002245); Guangdong Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (2023B1515020058); de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (2021A1515011639); het Major State Basic Research Development Program van de Natural Science Foundation van de provincie Shandong in China (ZR2020ZD11); de Stichting Postdoctorale Wetenschappen (2022M720059); het Outstanding Youths Development Scheme van het Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |