Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제
Summary
이 연구는 밀도 구배 원심분리(DGC)를 통해 인간의 대변에서 농축된 박테리아 세포외 소포체(BEV)를 분리 및 정제하는 방법을 설명하고, 형태, 입자 크기 및 농도에서 BEV의 물리적 특성을 식별하고, 임상 및 과학 연구에서 DGC 접근 방식의 잠재적 응용 분야에 대해 논의합니다.
Abstract
박테리아 세포외 소포체(BEV)는 박테리아-박테리아 및 박테리아-숙주 통신에 적극적인 역할을 하는 박테리아에서 파생된 나노소포체로, 모체 박테리아에서 물려받은 단백질, 지질 및 핵산과 같은 생체 활성 분자를 전달합니다. 장내 미생물군에서 유래한 BEV는 위장관 내에서 영향을 미치고 멀리 떨어진 장기에 도달할 수 있어 생리학 및 병리학에 상당한 영향을 미칩니다. 인간의 대변에서 유래한 BEV의 유형, 수량 및 역할을 탐구하는 이론적 연구는 장내 미생물군에서 BEV의 분비와 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 조사는 또한 BEV를 분리하고 정제하기 위한 현재 전략의 개선을 필요로 합니다.
이 연구는 하향식(Top-down)과 상향식(Bottom-up)의 두 가지 밀도 구배 원심분리(DGC) 모드를 설정하여 BEV의 분리 및 정제 프로세스를 최적화했습니다. BEV의 농축 분포는 분획 6 내지 8(F6-F8)로 결정하였다. 접근법의 효과는 입자 형태, 크기, 농도 및 단백질 함량을 기반으로 평가되었습니다. 입자 및 단백질 회수율을 계산하고 특정 마커의 존재를 분석하여 두 DGC 모드의 회수율과 순도를 비교했습니다. 그 결과 하향식 원심분리 모드는 오염 수준이 낮고 상향식 모드와 유사한 회수율과 순도를 달성한 것으로 나타났습니다. 7시간의 원심분리 시간은 108/mg의 분변 BEV 농도를 달성하기에 충분했습니다.
대변 외에도 이 방법은 성분과 점도의 차이에 따라 적절하게 수정하여 다른 체액 유형에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 이 상세하고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 BEV의 표준화된 분리 및 정제를 용이하게 하여 후속 다중 오믹스 분석 및 기능 실험을 위한 토대를 마련할 것입니다.
Introduction
소화관은 인체에서 가장 풍부한 미생물 군집을 보유한 기관으로 널리 알려져 있으며, 박테리아의 90% 이상이 집락 형성 및 증식에 관여합니다 1,2. 장내 미생물총(microbiota)이 장내 미세환경을 조절하고 동시에 주로 손상된 장 장벽(intestal barrier)을 통해 멀리 떨어진 장기의 기능 장애와 상호 작용한다는 광범위한 증거가 입증되었습니다 3,4. 장내 미생물군의 불균형과 염증성 장 질환(IBD)5,6 및 장-뇌 축 을 통한 인지 장애(5,6,7,8)의 진행 사이에 상관관계가 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. 박테리아에 의해 생성되는 박테리아 세포외 소포체(BEV)는 이러한 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.
BEV는 직경이 20nm에서 400nm에 이르는 박테리아 유도체를 캡슐화하는 나노 크기의 입자입니다. 박테리아와 숙주 유기체 사이의 상호작용을 촉진하는 것으로 입증되었다 9,10. 눈에 보이지 않음에도 불구하고, 이러한 입자는 진단 바이오마커, 치료 표적 및 약물 전달 수단으로서 광범위한 응용 분야로 인해 연구자들로부터 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다11. BEV 연구를 위한 생체 표본으로 자주 사용되는 인간 대변은 주로 장내 세균에서 추출하며 물, 박테리아, 지질, 단백질, 소화되지 않은 음식물 찌꺼기, 박리된 상피 세포의 복잡한 혼합물을 함유하고 있습니다. 복잡한 배설물 구성은 BEV의 분리 및 순도에 문제를 제기하여 BEV에 대한 포괄적이고 객관적이며 현실적인 분석을 방해합니다. 따라서 오염 부품의 간섭을 최소화하고 BEV의 수율을 높이기 위한 효과적인 전략이 즉각적인 주의가 필요한 중요한 문제로 떠올랐습니다.
기존의 분리 전략은 초고속 원심분리(UC), 밀도 구배 원심분리(DGC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)12,13,14,15,16,17과 같은 기술에 크게 의존합니다. 현재 DGC는 BEV 분리 분야에서 가장 널리 적용되는 방법 중 하나로, 시료의 초기 로딩 위치에 의해 결정되는 “하향식(Top-down)” 및 “상향식(Bottom-up)”의 두 가지 침전 부유 모드를 포함합니다. 이러한 방법론은 크기 및 밀도 차이에 따라 세포외 소포체(EV)를 다른 구성 요소와 구별하여 다양한 순도와 회수율을 제공합니다. 선행 연구에 따르면 단일 접근법 전략은 혈액 내 지단백질18 및 소변 내 Tamm-Horsfall 단백질과 같은 체액 샘플의 용해성 단백질에서 EV를 적절하게 분리하는 데 불충분하다고 합니다19. 또한 진핵 세포외 소포체(EEV)의 크기 분포는 BEV의 크기 분포와 겹치는 경우가 많으므로 BEV 수율을 최적화하기 위해 추가적인 방법론적 개선이 필요합니다. 결과적으로 BEV 연구의 발전은 효과적인 분리 및 정제 방법론의 개발에 달려 있습니다. 특히, Tulkens et al15는 EEV에서 분변 BEV를 분리하기 위해 직교 생물물리학 전략을 사용했으며, 상향식 DGC 모드의 원심분리 시간은 최대 18시간이었습니다. 대조적으로, 이 연구는 이를 7시간으로 줄여 그래디언트-초원심분리 시간을 크게 절약하고 프로세스를 단순화했습니다.
본 연구에서는 저속에서 극도로 빠른 속도까지 다양한 차등 원심분리 속도로 BEV를 농축한 후 최적화된 완충 조건에서 두 가지 DGC 모드를 사용하는 분변 BEV를 분리하고 정제했습니다. 형태학, 입자 크기 및 농도를 기반으로 한 평가는 이 향상된 방법으로 칭찬할 만한 성능을 나타냈습니다. 이 연구는 향후 연구의 토대가 될 수 있으며, 더 넓은 영역으로 응용 분야를 확장하고 인체 내 BEV의 이질성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 BEV 분리 및 분석 기술의 표준화에도 기여합니다.
Protocol
남방의과대학 난팡병원 윤리위원회는 참가자들의 사전 동의 하에 진행된 이 연구를 승인했다. 여기에 사용된 모든 방법은 국제 인간 마이크로바이옴 표준(IHMS: http://www.microbiome-standards.org/)에서 제공하는 표준 운영 지침을 준수했습니다. 이후의 모든 액체 취급 절차는 생물 안전 캐비닛 또는 매우 깨끗한 벤치 내에서 수행되어야 했습니다. 1. 분변 샘플의 채취 및 분취</stro…
Representative Results
BEV 농축 분획의 분포 결정박테리아 세포외 소포체(BEV)-농축 분획물의 분포를 결정하기 위해, OD 340nm에서 흡광도 값을 측정하기 위해 블랭크 대조군을 설정하고, 측정 및 요오드화놀 가이드라인을 기반으로 각 분획의 밀도를 계산하였다(단계 8.1). 표 2 는 밀도 결과를 제시하며, 분획 F4 내지 F9가 전형적으로 세포외 소포체와 관련된 범위 내에서 밀도를 나타낸다는 것을 ?…
Discussion
박테리아 세포외 소포체(BEV)는 박테리아가 분비하는 지질-이중층 나노입자로, 풍부한 단백질, 지질, 핵산 및 기타 생체 활성 분자를 운반하여 박테리아20의 기능적 효과를 매개하는 데 기여합니다. 장에서 유래한 BEV는 염증성 장 질환, 크론병, 대장암과 같은 질병의 발병에 관여하고 일반적인 대사에 영향을 미치고 인지 기능 장애를 중재하는 것으로 확인되었습니다 4,16,17,20,21,22,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 저명한 젊은 학자를 위한 국립 과학 기금(National Science Fund for Distinguished Young Scholars, 82025024)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 (82230080)의 핵심 프로젝트; 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2021YFA1300604); 중국 국립 자연 과학 재단 (81871735, 82272438 및 82002245); 저명한 젊은 학자를 위한 광둥성 자연과학 기금(2023B1515020058); 광둥성 자연과학재단(2021A1515011639); 중국 산둥성 자연과학재단의 주요 국가 기초 연구 개발 프로그램(ZR2020ZD11); 박사후 과학 재단(2022M720059); 남부 의과 대학 Nanfang 병원의 뛰어난 청소년 개발 계획(2022J001).
Materials
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
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Citazione di questo articolo
Xue, Y., Huang, X., Ou, Z., Wu, Y., Li, Q., Huang, X., Wen, M., Yang, Y., Situ, B., Zheng, L. Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (199), e65574, doi:10.3791/65574 (2023).