تصف هذه الدراسة طريقة لعزل وتنقية الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) المخصبة من البراز البشري عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وتحدد الخصائص الفيزيائية ل BEVs من التشكل وحجم الجسيمات والتركيز ، وتناقش التطبيقات المحتملة لنهج DGC في البحث السريري والعلمي.
الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) هي حويصلات نانوية مشتقة من البكتيريا التي تلعب دورا نشطا في التواصل بين البكتيريا والبكتيريا والبكتيريا المضيفة ، حيث تنقل الجزيئات النشطة بيولوجيا مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية الموروثة من البكتيريا الأم. BEVs المشتقة من ميكروبيوتا الأمعاء لها تأثيرات داخل الجهاز الهضمي ويمكن أن تصل إلى أعضاء بعيدة ، مما يؤدي إلى آثار كبيرة على علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض. تعد التحقيقات النظرية التي تستكشف أنواع وكميات وأدوار BEVs المشتقة من البراز البشري ضرورية لفهم إفراز ووظيفة BEVs من ميكروبات الأمعاء. تتطلب هذه التحقيقات أيضا تحسين الاستراتيجية الحالية لعزل وتنقية BEVs.
قامت هذه الدراسة بتحسين عملية عزل وتنقية BEVs من خلال إنشاء وضعين للطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC): من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى. تم تحديد التوزيع المخصب للخلايا الكهربائية في الكسور من 6 إلى 8 (F6-F8). تم تقييم فعالية النهج بناء على مورفولوجيا الجسيمات والحجم والتركيز ومحتوى البروتين. تم حساب معدلات استرداد الجسيمات والبروتين ، وتم تحليل وجود علامات محددة لمقارنة استعادة ونقاء وضعي DGC. أشارت النتائج إلى أن وضع الطرد المركزي من أعلى إلى أسفل كان له مستويات تلوث أقل وحقق معدل استرداد ونقاء مماثل لمعدل الطرد من أسفل إلى أعلى. كان وقت الطرد المركزي البالغ 7 ساعات كافيا لتحقيق تركيز BEV برازي يبلغ 108 / ملغ.
بصرف النظر عن البراز ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع سوائل الجسم الأخرى مع التعديل المناسب وفقا للاختلافات في المكونات واللزوجة. في الختام ، من شأن هذا البروتوكول المفصل والموثوق به أن يسهل عزل وتنقية BEVs الموحدة ، وبالتالي ، يضع أساسا لتحليل متعدد الأوميكس والتجارب الوظيفية اللاحقة.
تعرف الأمعاء على نطاق واسع بأنها العضو الذي يؤوي المجتمعات الميكروبية الأكثر وفرة في جسم الإنسان ، حيث يشارك أكثر من 90٪ من البكتيريا في الاستعمار والتكاثر 1,2. أظهرت أدلة واسعة النطاق أن ميكروبيوتا الأمعاء تعدل البيئة الدقيقة للأمعاء وتتفاعل في نفس الوقت مع الخلل الوظيفي في الأعضاء البعيدة ، في المقام الأول من خلال ضعف الحاجز المعوي 3,4. تشير الأدلة المتزايدة إلى وجود علاقة بين اختلال توازن ميكروبيوتا الأمعاء وتطور مرض التهاب الأمعاء (IBD) 5,6 ، وكذلك الاضطرابات المعرفية من خلال محور الأمعاءوالدماغ 5،6،7،8. تلعب الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) التي تنتجها البكتيريا أدوارا مهمة في هذه العمليات المرضية.
BEVs هي جسيمات نانوية تغلف المشتقات البكتيرية ، بأقطار تتراوح من 20 إلى 400 نانومتر. لقد ثبت أنها تسهل التفاعلات بين البكتيريا والكائنات الحية المضيفةلها 9,10. على الرغم من عدم ظهورها ، فقد حظيت هذه الجسيمات باهتمام متزايد من الباحثين بسبب تطبيقاتها الواسعة المحتملة كمؤشرات حيوية تشخيصية وأهداف علاجية ومركبات توصيل الأدوية11. البراز البشري ، الذي يستخدم غالبا كعينات حيوية لدراسة BEVs ، والذي يتم الحصول عليه في الغالب من بكتيريا الأمعاء ، يحتوي على مزيج معقد من الماء والبكتيريا والدهون والبروتينات وبقايا الطعام غير المهضومة والخلايا الظهارية المقشرة وغيرها. يشكل تكوين البراز المعقد تحديات لعزل ونقاء BEVs ، مما يعيق إجراء تحليل شامل وموضوعي وواقعي ل BEVs. ومن ثم ، ظهرت استراتيجيات فعالة لتقليل التداخل من المكونات الملوثة وتعزيز إنتاجية BEVs كقضايا حاسمة تستحق الاهتمام الفوري.
تعتمد استراتيجيات العزل الحالية إلى حد كبير على تقنيات مثل الطرد المركزي فائق السرعة (UC) ، والطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) 12،13،14،15،16،17. حاليا ، تعد DGC واحدة من أكثر الطرق المطبقة على نطاق واسع في مجال فصل BEV ، وتشمل وضعين عائمين للترسيب ، “من أعلى إلى أسفل” و “من أسفل إلى أعلى” ، والتي يتم تحديدها من خلال موضع التحميل الأولي للعينة. تميز هذه المنهجيات الحويصلات خارج الخلية (EVs) عن المكونات الأخرى بناء على تفاوتات الحجم والكثافة ، مما ينتج عنه معدلات نقاء واسترداد متغيرة. أشارت الأبحاث السابقة إلى أن استراتيجيات النهج الواحد غير كافية لفصل EVs بشكل مناسب عن البروتينات القابلة للذوبان في عينات سوائل الجسم ، مثل البروتين الدهني في الدم18 وبروتين Tamm-Horsfall في البول19. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يتداخل توزيع حجم الحويصلات خارج الخلية حقيقية النواة (EEVs) مع توزيع BEVs ، مما يستلزم المزيد من التحسينات المنهجية لتحسين إنتاجية BEV. وبالتالي ، فإن النهوض بدراسة BEVs يتوقف على تطوير منهجيات فعالة للفصل والتنقية. والجدير بالذكر أن Tulkens etal 15 استخدم استراتيجية فيزيائية حيوية متعامدة لفصل BEVs البرازية عن EEVs ، حيث كان وقت الطرد المركزي لوضع DGC من أسفل إلى أعلى يصل إلى 18 ساعة. في المقابل ، خفضت هذه الدراسة إلى 7 ساعات ، مما أدى إلى توفير وقت الطرد المركزي الفائق التدرج بشكل كبير وتبسيط العملية.
في هذه الدراسة ، قمنا بعزل وتنقية BEVs البرازية باستخدام وضعين DGC في ظل ظروف عازلة محسنة ، بعد إثراء BEVs بمجموعة من سرعات الطرد المركزي التفاضلية ، من السرعة المنخفضة إلى السرعة العالية للغاية. أشارت التقييمات القائمة على التشكل وحجم الجسيمات والتركيز إلى أداء جدير بالثناء من خلال هذه الطريقة المعززة. يمكن أن تكون هذه الدراسة بمثابة أساس للبحث المستقبلي ، وتوسيع تطبيقاتها إلى مجال أوسع ، وتقديم رؤى حول عدم تجانس BEVs داخل جسم الإنسان. كما أنه يساهم في توحيد تقنيات فصل وتحليل BEV.
الحويصلات البكتيرية خارج الخلية (BEVs) هي جسيمات نانوية ثنائية الطبقة تفرزها البكتيريا ، وتحمل ثروة من البروتينات والدهون والأحماض النووية وغيرها من الجزيئات النشطة بيولوجيا ، مما يساهم في التوسط في التأثيرات الوظيفية للبكتيريا20. تم التحقق من مشاركة BEVs المشتقة من الأمعاء في ت…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل الصندوق الوطني للعلوم للعلماء الشباب المتميزين (82025024) ؛ المشروع الرئيسي للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82230080) ؛ البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFA1300604)؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81871735 و 82272438 و 82002245) ؛ صندوق قوانغدونغ للعلوم الطبيعية للعلماء الشباب المتميزين (2023B1515020058) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ (2021A1515011639) ؛ برنامج تطوير البحوث الأساسية الرئيسي للدولة التابع لمؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة شاندونغ في الصين (ZR2020ZD11) ؛ مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه (2022M720059) ؛ مخطط تنمية الشباب المتميز لمستشفى نانفانغ ، الجامعة الطبية الجنوبية (2022J001).
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |