Pinza hiperglucémica y pinza hipoglucémica en ratones conscientes

Summary

Una pinza hiperglucémica se utiliza para medir la liberación de insulina con una concentración de glucosa en sangre más alta mantenida. Una pinza hipoglucémica sirve para medir la producción de glucosa inducida por respuestas contrarreguladoras. Ambos métodos utilizan el mismo procedimiento quirúrgico. En este trabajo se presenta una técnica de pinza para evaluar el metabolismo sistémico de la glucosa.

Abstract

La diabetes mellitus (DM) es causada por una liberación insuficiente de insulina de las células β pancreáticas (DM tipo 1) y sensibilidad a la insulina en los músculos, el hígado y los tejidos adiposos (DM tipo 2). La inyección de insulina trata a los pacientes con DM, pero conduce a la hipoglucemia como efecto secundario. El cortisol y las catecolaminas se liberan para activar la producción de glucosa del hígado para recuperar la hipoglucemia, lo que se denomina respuestas contrarreguladoras (RRC). En la investigación de la DM con modelos de roedores, se utilizan pruebas de tolerancia a la glucosa e inyección de 2-desoxiglucosa para medir la liberación de insulina y la RCR, respectivamente. Sin embargo, las concentraciones de glucosa en sangre cambian de forma persistente durante los experimentos, lo que dificulta la evaluación de la liberación neta de insulina y la RRC. Este artículo describe un método en el que la glucosa en sangre se mantiene en 250 mg/dL o 50 mg/dL en ratones conscientes para comparar la liberación de insulina y hormonas CRR, respectivamente.

Se implantan tubos de polietileno en la arteria carótida y la vena yugular de los ratones, y se permite que los ratones se recuperen de la cirugía. El tubo de la vena yugular se conecta a una jeringa Hamilton con una bomba de jeringa para permitir la infusión de insulina o glucosa a una velocidad constante y variable. El tubo de la arteria carótida es para la extracción de sangre. Para la pinza hiperglucémica, se infunde un 30% de glucosa en la vena y los niveles de glucosa en sangre se miden de la sangre arterial cada 5 minutos o 10 minutos. La velocidad de infusión de glucosa al 30% se incrementa hasta que el nivel de glucosa en sangre llega a 250 mg/dL. Se recolecta sangre para medir las concentraciones de insulina. Para el pinzamiento hipoglucémico, se infunde 10 mU/kg/min de insulina junto con un 30% de glucosa, cuya velocidad de infusión es variable para mantener 50 mg/dL de nivel de glucosa en sangre. La sangre se extrae para medir las hormonas contrarreguladoras cuando tanto la infusión de glucosa como la glucosa en sangre alcanzan un estado estacionario. Tanto las pinzas hiperglucémicas como las hipoglucémicas tienen el mismo procedimiento quirúrgico y configuraciones experimentales. Por lo tanto, este método es útil para los investigadores del metabolismo sistémico de la glucosa.

Introduction

La glucosa es una fuente importante de energía para las células, y la falta de glucosa puede provocar una variedad de síntomas y complicaciones. En el caso de glucosa baja (hipoglucemia, generalmente inferior a 70 mg/dL en el nivel de glucosa en sangre en ayunas, pero no debe determinarse por un solo valor¹), los síntomas más comunes incluyen debilidad, confusión, sudoración y dolor de cabeza. También puede alterar la función cerebral y aumentar el riesgo de eventos cardiovasculares y mortalidad². Por el contrario, la hiperglucemia es una afección médica en la que la concentración de glucosa plasmática supera los niveles normales (generalmente > 126 mg/dL en^{el nivel 3} de glucosa en sangre en ayunas). Esto puede ocurrir en personas con diabetes que tienen un déficit en la producción o utilización de insulina. La hiperglucemia puede conducir a la cetoacidosis diabética, que ocurre cuando el cuerpo no puede usar la glucosa para obtener energía, sino que descompone los ácidos grasos como combustible. El estado hiperglucémico e hiperosmolar también aumenta la mortalidad⁴. La hiperglucemia a largo plazo puede causar daños en los vasos sanguíneos, los nervios y los órganos, lo que lleva al desarrollo de varias complicaciones crónicas como enfermedades cardiovasculares, retinopatías y enfermedades renales. Por lo tanto, la concentración de glucosa en sangre debe mantenerse en un rango estrecho entre 100 mg/dL y 120 mg/dL.

La glucosa en sangre está regulada por el equilibrio entre la entrada y la salida de glucosa en un modelo de un compartimento (Figura 1A). El aporte de glucosa incluye la glucosa absorbida de los alimentos y la producción de glucosa del hígado, los riñones y el intestino delgado. La producción de glucosa comprende la absorción de glucosa en los tejidos y la eliminación de glucosa de los riñones. Tanto la cantidad de entrada como la salida de glucosa están reguladas por hormonas endocrinas. Por ejemplo, el glucagón, la corticosterona y las catecolaminas, conocidas como hormonas contrarreguladoras, se liberan^{cuando los niveles} de glucosa en sangre disminuyen. Estimulan la descomposición del glucógeno y la síntesis de glucosa, principalmente del hígado; Estos procesos se conocen como glucogenólisis y gluconeogénesis, respectivamente. La hiperglucemia aumenta la liberación de insulina de las células β pancreáticas y estimula la absorción de glucosa en los músculos, los tejidos adiposos y el corazón 6,7,8,9. El ejercicio aumenta la captación de glucosa independiente de la insulina¹⁰. El sistema nervioso simpático aumenta la absorción de glucosa en los músculos y el tejido adiposo marrón ^6,11. Para medir la capacidad de regular el metabolismo de la glucosa en los tejidos periféricos, los investigadores suelen utilizar la prueba de tolerancia a la glucosa (GTT) y la prueba de tolerancia a la insulina (ITT) (Figura 1B, C). En la TGT hay que tener en cuenta dos factores: la liberación de insulina y la sensibilidad a la insulina (Figura 1B). Sin embargo, la curva de concentración de glucosa durante la prueba de 120 minutos es diferente en cada ratón, lo que puede afectar a diferentes cantidades de liberación de hormonas. En el ITT, la glucosa en sangre está regulada tanto por la sensibilidad a la insulina como por la liberación de hormonas contrarreguladoras. Por lo tanto, es difícil determinar el significado preciso del metabolismo de la glucosa, la liberación de insulina y la sensibilidad a la insulina en GTT e ITT, en situaciones en las que los niveles de glucosa en sangre no son constantes.

Para superar estos problemas, es deseable mantener la glucosa en sangre a un nivel constante (o “pinza”). En la pinza hiperglucémica, la glucosa se infunde en el torrente sanguíneo para elevar los niveles de glucosa en sangre a un nivel específico y luego se mantiene en ese nivel durante un período de tiempo. La cantidad de glucosa infundida se ajusta en función de las mediciones de los niveles de glucosa en sangre cada 5-10 minutos para mantener un estado estable. Esta técnica es particularmente útil para comprender los parámetros de secreción de insulina a un nivel de glucosa fijado. La pinza hipoglucémica es un método para mantener bajos los niveles de glucosa en sangre mediante la infusión de insulina. La glucosa se infunde a una velocidad variable para mantener un nivel específico de glucosa en sangre. Si el ratón no puede recuperarse de la hipoglucemia, se debe infundir más glucosa.

Aunque la realización de pinzas hiperglucémicas e hipoglucémicas tiene muchas ventajas, los procedimientos quirúrgicos y experimentales se consideran técnicamente difíciles. Así, pocos grupos de investigación han sido capaces de realizarlas. Nuestro objetivo fue describir estos métodos para que los investigadores con limitaciones financieras y de mano de obra comiencen estos experimentos con un presupuesto más bajo.

Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Kumamoto. NOTA: Para aliviar el dolor, se administró ibuprofeno en agua potable (0,11 mg/ml) durante 48 h, y buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg i.p.) 30 min antes de la cirugía. Las condiciones estériles incluyen guantes, máscaras e instrumentos esterilizados en autoclave con óxido de etileno entre animales. La cirugía se realizó en una almohadilla térmica ajustada…

Representative Results

El estudio de pinza hipoglucémica se realizó en ratones machos C57BL/6N (8 semanas de edad, más de 25 g de peso corporal) 3 h en ayunas al inicio del experimento (Figura 4A,B). El nivel inicial de glucosa en sangre fue de 136 mg/dl (t = -15 min). Si es inferior a 90 mg/dL, puede deberse a que la cirugía no salió bien, o a que el catéter arterial se insertó demasiado profundo, o a que han entrado coágulos de sangre en el flujo sanguíneo. La condición del ratón desp…

Discussion

El método descrito aquí es simple y se puede hacer con puntas de pipeta, jeringas y otros elementos que se encuentran en los laboratorios ordinarios. Aunque es posible que los investigadores necesiten comprar tubos y bombas adicionales, no se necesitan equipos costosos. Así, este protocolo de cateterismo y pinza es más fácil de iniciar en comparación con reportes previos 12,13,14.

La técnica de…

Materials

Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5