Pinza iperglicemica e pinza ipoglicemica nei topi coscienti

Summary

Un morsetto iperglicemico viene utilizzato per misurare il rilascio di insulina con una concentrazione di glucosio nel sangue più elevata. Un morsetto ipoglicemico serve a misurare la produzione di glucosio indotta da risposte controregolatorie. Entrambi i metodi utilizzano la stessa procedura chirurgica. Qui, presentiamo una tecnica di clamp per valutare il metabolismo sistemico del glucosio.

Abstract

Il diabete mellito (DM) è causato da un insufficiente rilascio di insulina dalle cellule β pancreatiche (DM di tipo 1) e dalla sensibilità all’insulina nei muscoli, nel fegato e nei tessuti adiposi (DM di tipo 2). L’iniezione di insulina tratta i pazienti affetti da DM, ma porta all’ipoglicemia come effetto collaterale. Il cortisolo e le catecolamine vengono rilasciati per attivare la produzione di glucosio dal fegato per recuperare l’ipoglicemia, chiamate risposte controregolatorie (CRR). Nella ricerca sul DM che utilizza modelli di roditori, i test di tolleranza al glucosio e l’iniezione di 2-deossi-glucosio vengono utilizzati per misurare rispettivamente il rilascio di insulina e il CRR. Tuttavia, le concentrazioni di glucosio nel sangue cambiano in modo persistente durante gli esperimenti, causando difficoltà nella valutazione del rilascio netto di insulina e del CRR. Questo articolo descrive un metodo in cui la glicemia viene mantenuta a 250 mg/dL o 50 mg/dL in topi coscienti per confrontare il rilascio di insulina e ormoni CRR, rispettivamente.

Un tubo di polietilene viene impiantato nell’arteria carotide e nella vena giugulare dei topi e i topi possono riprendersi dall’intervento chirurgico. Il tubo della vena giugulare è collegato a una siringa Hamilton con una pompa a siringa per consentire l’infusione di insulina o glucosio a una velocità costante e variabile. Il tubo dell’arteria carotide serve per la raccolta del sangue. Per il morsetto iperglicemico, il glucosio al 30% viene infuso nella vena e i livelli di glucosio nel sangue vengono misurati dal sangue arterioso ogni 5 minuti o 10 minuti. La velocità di infusione del glucosio al 30% viene aumentata fino a quando il livello di glucosio nel sangue diventa di 250 mg/dL. Il sangue viene raccolto per misurare le concentrazioni di insulina. Per il morsetto ipoglicemico, 10 mU/kg/min di insulina vengono infusi insieme al 30% di glucosio, la cui velocità di infusione è variabile per mantenere un livello di glucosio nel sangue di 50 mg/dL. Il sangue viene raccolto per misurare gli ormoni controregolatori quando sia l’infusione di glucosio che la glicemia raggiungono uno stato stazionario. Sia le pinze iperglicemiche che quelle ipoglicemiche hanno la stessa procedura chirurgica e le stesse configurazioni sperimentali. Pertanto, questo metodo è utile per i ricercatori del metabolismo sistemico del glucosio.

Introduction

Il glucosio è un’importante fonte di energia per le cellule e la mancanza di glucosio può portare a una varietà di sintomi e complicazioni. In caso di ipoglicemia (ipoglicemia, generalmente inferiore a 70 mg/dL nel livello di glucosio nel sangue a digiuno, ma non deve essere determinato da un singolo valore¹), i sintomi più comuni includono debolezza, confusione, sudorazione e mal di testa. Può anche interrompere la funzione cerebrale e aumentare il rischio di eventi cardiovascolari e mortalità². Al contrario, l’iperglicemia è una condizione medica in cui la concentrazione plasmatica di glucosio supera i livelli normali (generalmente > 126 mg/dL nel livello di glucosio^{nel sangue a} digiuno 3). Ciò può verificarsi in individui con diabete che hanno un deficit nella produzione o nell’utilizzo dell’insulina. L’iperglicemia può portare alla chetoacidosi diabetica, che si verifica quando il corpo non può utilizzare il glucosio per produrre energia, ma scompone invece gli acidi grassi come carburante. Lo stato iperglicemico iperosmolare aumenta anche la mortalità⁴. L’iperglicemia a lungo termine può causare danni ai vasi sanguigni, ai nervi e agli organi, portando allo sviluppo di diverse complicazioni croniche come malattie cardiovascolari, retinopatie e malattie renali. Pertanto, la concentrazione di glucosio nel sangue deve essere mantenuta in un intervallo ristretto tra 100 mg/dL e 120 mg/dL.

La glicemia è regolata dall’equilibrio tra l’ingresso e l’uscita di glucosio in un modello a un compartimento (Figura 1A). L’apporto di glucosio comprende il glucosio assorbito dal cibo e la produzione di glucosio dal fegato, dai reni e dall’intestino tenue. La produzione di glucosio comprende l’assorbimento del glucosio nei tessuti e lo smaltimento del glucosio dai reni. Sia la quantità di glucosio in ingresso che in uscita sono regolate dagli ormoni endocrini. Ad esempio, glucagone, corticosterone e catecolamine, noti come ormoni controregolatori, vengono rilasciati quando i livelli di glucosio nel sangue diminuiscono⁵. Stimolano la scomposizione del glicogeno e la sintesi del glucosio, principalmente dal fegato; Questi processi sono noti rispettivamente come glicogenolisi e gluconeogenesi. L’iperglicemia aumenta il rilascio di insulina dalle cellule β pancreatiche e stimola l’assorbimento del glucosio nei muscoli, nei tessuti adiposi e nel cuore 6,7,8,9. L’esercizio fisico aumenta l’assorbimento del glucosio insulino-indipendente¹⁰. Il sistema nervoso simpatico aumenta l’assorbimento del glucosio nei muscoli e nel tessuto adiposo bruno ^6,11. Per misurare la capacità di regolare il metabolismo del glucosio nei tessuti periferici, i ricercatori utilizzano in genere il test di tolleranza al glucosio (GTT) e il test di tolleranza all’insulina (ITT) (Figura 1B,C). Nella GTT, devono essere considerati due fattori: il rilascio di insulina e la sensibilità all’insulina (Figura 1B). Tuttavia, la curva di concentrazione del glucosio durante il test di 120 minuti è diversa in ogni topo, il che può influenzare diverse quantità di rilascio ormonale. Nell’ITT, la glicemia è regolata sia dalla sensibilità all’insulina che dal rilascio di ormoni controregolatori. Pertanto, è difficile determinare il significato preciso del metabolismo del glucosio, del rilascio di insulina e della sensibilità all’insulina in GTT e ITT, in situazioni in cui i livelli di glucosio nel sangue non sono costanti.

Per ovviare a questi problemi, è auspicabile mantenere la glicemia a un livello costante (o “clamp”). Nel clamp iperglicemico, il glucosio viene infuso nel flusso sanguigno per aumentare i livelli di glucosio nel sangue a un livello specifico e quindi mantenuto a quel livello per un periodo di tempo. La quantità di glucosio infuso viene regolata in base alle misurazioni dei livelli di glucosio nel sangue ogni 5-10 minuti per mantenere uno stato stazionario. Questa tecnica è particolarmente utile per comprendere i parametri della secrezione di insulina a un livello di glucosio bloccato. Il morsetto ipoglicemico è un metodo per mantenere bassi i livelli di glucosio nel sangue mediante infusione di insulina. Il glucosio viene infuso a una velocità variabile per mantenere un livello specifico di glucosio nel sangue. Se il topo non riesce a riprendersi dall’ipoglicemia, deve essere infuso più glucosio.

Sebbene ci siano molti vantaggi nell’eseguire pinze iperglicemiche e ipoglicemiche, le procedure chirurgiche e sperimentali sono considerate tecnicamente difficili. Pertanto, pochi gruppi di ricerca sono stati in grado di farlo. Il nostro obiettivo era quello di descrivere questi metodi per i ricercatori con vincoli finanziari e di forza lavoro per avviare questi esperimenti con un budget inferiore.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università di Kumamoto. NOTA: Per alleviare il dolore, l’ibuprofene è stato somministrato in acqua potabile (0,11 mg/ml) per 48 ore e la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg i.p.) è stata somministrata 30 minuti prima dell’intervento chirurgico. Le condizioni sterili includono guanti, maschere e strumenti sterilizzati in autoclave con ossido di etilene tra gli animali. L’intervento è stato eseguit…

Representative Results

Lo studio del clamp ipoglicemico è stato eseguito su topi maschi C57BL/6N (8 settimane di età, più di 25 g di peso corporeo) 3 ore a digiuno all’inizio dell’esperimento (Figura 4A,B). Il livello iniziale di glucosio nel sangue era di 136 mg/dL (t = -15 min). Se è inferiore a 90 mg/dL, potrebbe essere perché l’intervento chirurgico non è andato bene, o il catetere arterioso è stato inserito troppo in profondità, o i coaguli di sangue sono entrati nel flusso sanguigno….

Discussion

Il metodo qui descritto è semplice e può essere eseguito con puntali per pipette, siringhe e altri oggetti che si trovano nei normali laboratori. Sebbene i ricercatori possano aver bisogno di acquistare tubi e pompe aggiuntivi, non sono necessarie attrezzature costose. Pertanto, questo protocollo di cateterismo e clamp è più facile da avviare rispetto ai precedenti rapporti 12,13,14.

La tecnica de…

Materials

Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5