Hyperglykämische Klemme und hypoglykämische Klemme bei bewussten Mäusen
Summary
Eine hyperglykämische Klemme wird zur Messung der Insulinfreisetzung bei anhaltend höherer Blutzuckerkonzentration verwendet. Eine hypoglykämische Klemme dient zur Messung der Glukoseproduktion, die durch gegenregulatorische Reaktionen induziert wird. Beide Methoden verwenden das gleiche chirurgische Verfahren. Hier stellen wir eine Clamp-Technik zur Beurteilung des systemischen Glukosestoffwechsels vor.
Abstract
Diabetes mellitus (DM) wird durch eine unzureichende Insulinausschüttung aus den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse (Typ1-DM) und eine Insulinsensitivität in Muskeln, Leber und Fettgewebe (Typ2-DM) verursacht. Die Insulininjektion behandelt DM-Patienten, führt jedoch als Nebenwirkung zu Hypoglykämie. Cortisol und Katecholamine werden freigesetzt, um die Glukoseproduktion aus der Leber zu aktivieren, um eine Hypoglykämie wiederherzustellen, die als gegenregulatorische Reaktionen (CRR) bezeichnet wird. In der DM-Forschung mit Nagetiermodellen werden Glukosetoleranztests und 2-Desoxyglukose-Injektion verwendet, um die Insulinfreisetzung bzw. CRR zu messen. Die Blutzuckerkonzentrationen ändern sich jedoch während der Experimente anhaltend, was zu Schwierigkeiten bei der Beurteilung der Nettoinsulinfreisetzung und der CRR führt. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, bei der der Blutzucker bei bewussten Mäusen bei 250 mg/dl oder 50 mg/dl gehalten wird, um die Freisetzung von Insulin bzw. CRR-Hormonen zu vergleichen.
Polyethylenschläuche werden in die Halsschlagader und die Halsvene der Mäuse implantiert, und die Mäuse können sich von der Operation erholen. Der Jugularvenenschlauch ist mit einer Hamilton-Spritze mit einer Spritzenpumpe verbunden, um eine Insulin- oder Glukoseinfusion mit einer konstanten und variablen Rate zu ermöglichen. Der Karotisschlauch dient der Blutentnahme. Bei der hyperglykämischen Klemme werden 30% Glukose in die Vene infundiert, und der Blutzuckerspiegel wird alle 5 oder 10 Minuten aus dem arteriellen Blut gemessen. Die Infusionsrate von 30% Glukose wird erhöht, bis der Blutzuckerspiegel 250 mg/dl erreicht. Blut wird entnommen, um die Insulinkonzentration zu messen. Bei hypoglykämischer Klemme werden 10 mU/kg/min Insulin zusammen mit 30% Glukose infundiert, deren Infusionsrate variabel ist, um einen Blutzuckerspiegel von 50 mg/dl aufrechtzuerhalten. Blut wird gesammelt, um gegenregulatorische Hormone zu messen, wenn sowohl die Glukoseinfusion als auch der Blutzucker einen stabilen Zustand erreichen. Sowohl hyperglykämische als auch hypoglykämische Klemmen haben das gleiche chirurgische Verfahren und den gleichen Versuchsaufbau. Daher ist diese Methode für Forscher des systemischen Glukosestoffwechsels nützlich.
Introduction
Glukose ist eine wichtige Energiequelle für Zellen, und ein Mangel an Glukose kann zu einer Vielzahl von Symptomen und Komplikationen führen. Bei niedrigem Glukosespiegel (Hypoglykämie, im Allgemeinen weniger als 70 mg/dl im Nüchternblutzuckerspiegel, sollte aber nicht durch einen einzigen Wertbestimmt werden 1) sind die häufigsten Symptome Schwäche, Verwirrtheit, Schwitzen und Kopfschmerzen. Es kann auch die Gehirnfunktion stören und das Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse und Mortalität erhöhen2. Umgekehrt ist Hyperglykämie eine Erkrankung, bei der die Plasmaglukosekonzentration die normalen Werte überschreitet (im Allgemeinen > 126 mg/dl bei Nüchternblutzuckerspiegel3). Dies kann bei Personen mit Diabetes auftreten, die entweder ein Defizit in der Insulinproduktion oder -verwertung haben. Hyperglykämie kann zu diabetischer Ketoazidose führen, die auftritt, wenn der Körper Glukose nicht zur Energiegewinnung verwenden kann, sondern stattdessen Fettsäuren als Brennstoff abbaut. Der hyperglykämische hyperosmolare Zustand erhöht auch die Mortalität4. Langfristige Hyperglykämie kann Blutgefäße, Nerven und Organe schädigen und zur Entwicklung mehrerer chronischer Komplikationen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Retinopathien und Nierenerkrankungen führen. Daher muss die Blutzuckerkonzentration in einem engen Bereich zwischen 100 mg/dl und 120 mg/dl gehalten werden.
Der Blutzucker wird durch das Gleichgewicht zwischen Glukosezufuhr und -ausgang in einem Einkompartimentmodell reguliert (Abbildung 1A). Der Glukoseeintrag umfasst absorbierte Glukose aus der Nahrung und die Glukoseproduktion aus Leber, Nieren und Dünndarm. Die Glukoseproduktion umfasst die Glukoseaufnahme im Gewebe und die Glukoseentsorgung aus den Nieren. Sowohl die Menge der Glukosezufuhr als auch die Glukoseabgabe werden durch endokrine Hormone reguliert. Zum Beispiel werden Glucagon, Corticosteron und Katecholamine, die als gegenregulatorische Hormone bekannt sind, freigesetzt, wenn der Blutzuckerspiegel sinkt5. Sie stimulieren den Abbau von Glykogen und die Synthese von Glukose, hauptsächlich aus der Leber; Diese Prozesse werden als Glykogenolyse bzw. Glukoneogenese bezeichnet. Hyperglykämie erhöht die Insulinfreisetzung aus den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse und stimuliert die Glukoseaufnahme in den Muskeln, im Fettgewebe und im Herzen 6,7,8,9. Bewegung erhöht die insulinunabhängige Glukoseaufnahme10. Das sympathische Nervensystem erhöht die Glukoseaufnahme in Muskeln und braunem Fettgewebe 6,11. Um die Fähigkeit zu messen, den Glukosestoffwechsel in peripheren Geweben zu regulieren, verwenden Forscher typischerweise den Glukosetoleranztest (GTT) und den Insulintoleranztest (ITT) (Abbildung 1B, C). Bei GTT müssen zwei Faktoren berücksichtigt werden: Insulinfreisetzung und Insulinsensitivität (Abbildung 1B). Die Glukosekonzentrationskurve während des 120-minütigen Tests ist jedoch bei jeder Maus unterschiedlich, was sich auf unterschiedliche Mengen der Hormonfreisetzung auswirken kann. Bei ITT wird der Blutzucker sowohl durch die Insulinsensitivität als auch durch die Freisetzung von gegenregulatorischen Hormonen reguliert. Daher ist es schwierig, die genaue Bedeutung des Glukosestoffwechsels, der Insulinfreisetzung und der Insulinsensitivität in GTT und ITT in Situationen zu bestimmen, in denen der Blutzuckerspiegel nicht konstant ist.
Um diese Probleme zu überwinden, ist es wünschenswert, den Blutzucker auf einem konstanten Niveau zu halten (oder “Klemme”). Bei hyperglykämischer Klemme wird Glukose in den Blutkreislauf infundiert, um den Blutzuckerspiegel auf ein bestimmtes Niveau zu erhöhen, und dann für einen bestimmten Zeitraum auf diesem Niveau gehalten. Die Menge der infundierten Glukose wird auf der Grundlage von Messungen des Blutzuckerspiegels alle 5-10 Minuten angepasst, um einen stabilen Zustand aufrechtzuerhalten. Diese Technik ist besonders nützlich, um die Parameter der Insulinsekretion bei einem geklemmten Glukosespiegel zu verstehen. Hypoglykämische Klemme ist eine Methode zur Aufrechterhaltung eines niedrigen Blutzuckerspiegels durch Injektion von Insulin. Glukose wird mit einer variablen Rate infundiert, um einen bestimmten Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten. Wenn sich die Maus nicht von einer Hypoglykämie erholen kann, sollte mehr Glukose infundiert werden.
Obwohl die Durchführung von hyperglykämischen und hypoglykämischen Klemmen viele Vorteile bietet, gelten die chirurgischen und experimentellen Verfahren als technisch schwierig. Daher waren nur wenige Forschungsgruppen in der Lage, dies zu tun. Unser Ziel war es, diese Methoden für Forscher mit finanziellen und personellen Einschränkungen zu beschreiben, um diese Experimente mit einem geringeren Budget zu starten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode ist eine einfache Methode, die mit Pipettenspitzen, Spritzen und anderen Gegenständen durchgeführt werden kann, die in normalen Labors zu finden sind. Obwohl Forscher möglicherweise zusätzliche Schläuche und Pumpen kaufen müssen, werden keine teure Ausrüstung benötigt. Daher ist dieses Protokoll der Katheterisierung und Klemme im Vergleich zu früheren Berichten einfacher zu starten 12,13,14.</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Leading Initiative for Excellent Young Researchers (von MEXT); ein Zuschuss für wissenschaftliche Forschung (B) (Fördernummer JP21H02352); Japanische Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED-RPIME, Fördernummer JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); die Uehara Memorial Foundation; Astellas Foundation für die Erforschung von Stoffwechselstörungen; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation und Narishige Neuroscience Research Foundation. Wir danken auch Nur Farehan Asgar, Ph.D., für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts.
Materials
| Adhesive glue | Henkel AG & Co. KGaA | LOCTITE 454 | |
| ELISA kit (C-peptide) | Morinaga Institute of Bilogical Science Inc | M1304 | Mouse C-peptide ELISA Kit |
| ELISA kit (insulin) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 633-03411 | LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type) |
| Handy glucose meter | Nipro Co. | 11-777 | Free Style Freedom Lite |
| Insulin (100U/ml) | Eli Lilly & Co. | 428021014 | Humulin R (100U/ml) |
| Mouse | Japan SLC Inc. | C57BL/6NCrSlc | C57BL |
| Suture | Natsume seisakusho | C-23S-560 No.2 | Sterilized |
| Syringe Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Synthetic suture | VÖMEL | HR-17 | |
| Tubing1 | AS ONE Corporation | 9-869-01 | LABORAN(R) Silicone Tube |
| Tubing2 | Fisher Scientific | 427400 | BD Intramedic PE Tubing |
| Tubing3 | IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. | size5 | Polyethylene tubing size5 |
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