Pince hyperglycémique et pince hypoglycémique chez la souris consciente

Summary

Une pince hyperglycémique est utilisée pour mesurer la libération d’insuline avec une concentration de glucose sanguin plus élevée. Un clamp hypoglycémique sert à mesurer la production de glucose induite par des réponses contre-régulatrices. Les deux méthodes utilisent la même procédure chirurgicale. Ici, nous présentons une technique de clamp pour évaluer le métabolisme systémique du glucose.

Abstract

Le diabète sucré (DS) est causé par une libération insuffisante d’insuline par les cellules β pancréatiques (diabète de type 1) et une sensibilité à l’insuline dans les muscles, le foie et les tissus adipeux (diabète de type 2). L’injection d’insuline traite les patients atteints de diabète sucré mais entraîne une hypoglycémie comme effet secondaire. Le cortisol et les catécholamines sont libérés pour activer la production de glucose du foie afin de récupérer l’hypoglycémie, appelée réponse contre-régulatrice (CRR). Dans la recherche sur le diabète à l’aide de modèles de rongeurs, des tests de tolérance au glucose et l’injection de 2-désoxyglucose sont utilisés pour mesurer la libération d’insuline et la CRR, respectivement. Cependant, les concentrations de glucose dans le sang changent constamment au cours des expériences, ce qui rend difficile l’évaluation de la libération nette d’insuline et de la CRR. Cet article décrit une méthode dans laquelle la glycémie est maintenue à 250 mg/dL ou 50 mg/dL chez des souris conscientes pour comparer la libération d’insuline et d’hormones CRR, respectivement.

Un tube en polyéthylène est implanté dans l’artère carotide et la veine jugulaire des souris, et les souris sont autorisées à se remettre de la chirurgie. Le tube de la veine jugulaire est relié à une seringue Hamilton avec un pousse-seringue pour permettre la perfusion d’insuline ou de glucose à un débit constant et variable. Le tube de l’artère carotide sert à la collecte de sang. Pour le clamp hyperglycémique, 30 % de glucose est perfusé dans la veine et la glycémie est mesurée à partir du sang artériel toutes les 5 ou 10 minutes. Le débit de perfusion de 30 % de glucose est augmenté jusqu’à ce que la glycémie atteigne 250 mg/dL. Le sang est prélevé pour mesurer les concentrations d’insuline. Pour le clamp hypoglycémiant, 10 mU/kg/min d’insuline sont perfusés avec 30% de glucose, dont le débit de perfusion est variable pour maintenir 50 mg/dL de glycémie. Le sang est prélevé pour mesurer les hormones contre-régulatrices lorsque la perfusion de glucose et la glycémie atteignent un état d’équilibre. Les pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques ont la même procédure chirurgicale et les mêmes configurations expérimentales. Ainsi, cette méthode est utile pour les chercheurs sur le métabolisme systémique du glucose.

Introduction

Le glucose est une source d’énergie importante pour les cellules, et un manque de glucose peut entraîner divers symptômes et complications. En cas d’hypoglycémie (hypoglycémie, généralement inférieure à 70 mg/dL de glycémie à jeun, mais ne doit pas être déterminée par une seule valeur¹), les symptômes les plus courants sont la faiblesse, la confusion, la transpiration et les maux de tête. Il peut également perturber la fonction cérébrale et augmenter le risque d’événements cardiovasculaires et de mortalité². À l’inverse, l’hyperglycémie est une condition médicale dans laquelle la concentration plasmatique de glucose dépasse les niveaux normaux (généralement > 126 mg/dL en glycémie à jeun³). Cela peut se produire chez les personnes atteintes de diabète qui présentent un déficit de production ou d’utilisation d’insuline. L’hyperglycémie peut entraîner une acidocétose diabétique, qui se produit lorsque le corps ne peut pas utiliser le glucose comme énergie mais décompose les acides gras comme carburant. L’état hyperosmolaire hyperglycémique augmente également la mortalité⁴. L’hyperglycémie à long terme peut endommager les vaisseaux sanguins, les nerfs et les organes, entraînant le développement de plusieurs complications chroniques telles que les maladies cardiovasculaires, les rétinopathies et les maladies rénales. Ainsi, la glycémie doit être maintenue dans une fourchette étroite entre 100 mg/dL et 120 mg/dL.

La glycémie est régulée par l’équilibre entre l’entrée et la sortie de glucose dans un modèle à un compartiment (Figure 1A). L’apport en glucose comprend le glucose absorbé par les aliments et la production de glucose par le foie, les reins et l’intestin grêle. La production de glucose comprend l’absorption du glucose dans les tissus et l’élimination du glucose par les reins. La quantité de glucose entrant et sortant est régulée par les hormones endocriniennes. Par exemple, le glucagon, la corticostérone et les catécholamines, connus sous le nom d’hormones contre-régulatrices, sont libérés lorsque la glycémie diminue⁵. Ils stimulent la dégradation du glycogène et la synthèse du glucose, principalement du foie ; Ces processus sont connus sous le nom de glycogénolyse et de gluconéogenèse, respectivement. L’hyperglycémie augmente la libération d’insuline par les cellules β pancréatiques et stimule l’absorption du glucose dans les muscles, les tissus adipeux et le cœur 6,7,8,9. L’exercice augmente l’absorption de glucose indépendante de l’insuline¹⁰. Le système nerveux sympathique augmente l’absorption du glucose dans les muscles et le tissu adipeux brun ^6,11. Pour mesurer la capacité à réguler le métabolisme du glucose dans les tissus périphériques, les chercheurs utilisent généralement le test de tolérance au glucose (GTT) et le test de tolérance à l’insuline (ITT) (Figure 1B,C). Dans le GTT, deux facteurs doivent être pris en compte : la libération d’insuline et la sensibilité à l’insuline (Figure 1B). Cependant, la courbe de concentration de glucose pendant le test de 120 minutes est différente chez chaque souris, ce qui peut affecter différentes quantités de libération d’hormones. Dans le cas de l’ITT, la glycémie est régulée à la fois par la sensibilité à l’insuline et la libération d’hormones contre-régulatrices. Par conséquent, il est difficile de déterminer la signification précise du métabolisme du glucose, de la libération d’insuline et de la sensibilité à l’insuline dans les situations où la glycémie n’est pas constante.

Pour surmonter ces problèmes, il est souhaitable de maintenir la glycémie à un niveau constant (ou « clamp »). Dans le clamp hyperglycémique, le glucose est infusé dans la circulation sanguine pour augmenter la glycémie à un niveau spécifique, puis maintenu à ce niveau pendant un certain temps. La quantité de glucose infusé est ajustée en fonction des mesures de la glycémie toutes les 5 à 10 minutes pour maintenir un état d’équilibre. Cette technique est particulièrement utile pour comprendre les paramètres de la sécrétion d’insuline à un taux de glucose clampé. Le clamp hypoglycémique est une méthode pour maintenir une glycémie basse en perfusant de l’insuline. Le glucose est perfusé à un rythme variable pour maintenir un taux de glucose sanguin spécifique. Si la souris ne peut pas se remettre de l’hypoglycémie, plus de glucose doit être perfusé.

Bien qu’il y ait de nombreux avantages à effectuer des pinces hyperglycémiques et hypoglycémiques, les procédures chirurgicales et expérimentales sont considérées comme techniquement difficiles. Ainsi, peu de groupes de recherche ont pu les faire. Nous avons cherché à décrire ces méthodes pour les chercheurs ayant des contraintes financières et de main-d’œuvre afin de démarrer ces expériences avec un budget inférieur.

Protocol

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Kumamoto. REMARQUE : Pour soulager la douleur, l’ibuprofène a été administré dans l’eau potable (0,11 mg/mL) pendant 48 h, et la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg i.p.) a été administrée 30 min avant la chirurgie. Les conditions stériles comprennent les gants, les masques et les instruments autoclavés stérilisés à l’oxyde d’éthylène …

Representative Results

L’étude sur l’hypoglycémie clamp a été réalisée chez des souris C57BL/6N mâles (âgées de 8 semaines, plus de 25 g p.c.) à jeun 3 h au début de l’expérience (figure 4A, B). La glycémie initiale était de 136 mg/dL (t = -15 min). S’il est inférieur à 90 mg/dL, cela peut être dû au fait que la chirurgie ne s’est pas bien déroulée, ou que le cathéter artériel a été inséré trop profondément, ou que des caillots sanguins ont pénétré dans le f…

Discussion

La méthode décrite ici est simple et peut être réalisée avec des pointes de pipette, des seringues et d’autres articles trouvés dans les laboratoires ordinaires. Bien que les chercheurs puissent avoir besoin d’acheter des tubes et des pompes supplémentaires, aucun équipement coûteux n’est nécessaire. Ainsi, ce protocole de cathétérisme et de clampage est plus facile à démarrer par rapport aux rapports précédents 12,13,14.<sup clas…

Materials

Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5