Clamp hiperglicêmico e grampo hipoglicêmico em camundongos conscientes

Summary

Um clamp hiperglicêmico é usado para medir a liberação de insulina com uma concentração de glicose no sangue mais alta mantida. Uma pinça hipoglicemiante serve para medir a produção de glicose induzida por respostas contra-regulatórias. Ambos os métodos utilizam o mesmo procedimento cirúrgico. Apresentamos aqui uma técnica de clamp para avaliar o metabolismo sistêmico da glicose.

Abstract

O diabetes mellitus (DM) é causado pela liberação insuficiente de insulina das células β pancreáticas (DM tipo 1) e sensibilidade à insulina nos músculos, fígado e tecido adiposo (DM tipo 2). A injeção de insulina trata pacientes com DM, mas leva à hipoglicemia como efeito colateral. O cortisol e as catecolaminas são liberados para ativar a produção de glicose do fígado para recuperar a hipoglicemia, chamadas de respostas contrarregulatórias (CRR). Na pesquisa de DM usando modelos de roedores, testes de tolerância à glicose e injeção de 2-desoxiglicose são usados para medir a liberação de insulina e CRR, respectivamente. No entanto, as concentrações de glicose no sangue mudam persistentemente durante os experimentos, causando dificuldades na avaliação da liberação líquida de insulina e da RCR. Este artigo descreve um método no qual a glicemia é mantida em 250 mg/dL ou 50 mg/dL em camundongos conscientes para comparar a liberação de insulina e hormônios CRR, respectivamente.

A tubulação de polietileno é implantada na artéria carótida e na veia jugular dos camundongos, e os camundongos podem se recuperar da cirurgia. A tubulação da veia jugular é conectada a uma seringa de Hamilton com uma bomba de seringa para permitir a infusão de insulina ou glicose a uma taxa constante e variável. A tubulação da artéria carótida é para coleta de sangue. Para a pinça hiperglicêmica, 30% de glicose é infundida na veia, e os níveis de glicose no sangue são medidos a partir do sangue arterial a cada 5 min ou 10 min. A taxa de infusão de glicose a 30% é aumentada até que o nível de glicose no sangue se torne 250 mg/dL. O sangue é coletado para medir as concentrações de insulina. Para a pinça hipoglicemiante, infunde-se insulina 10 mU/kg/min juntamente com glicose a 30%, cuja velocidade de infusão é variável para manter 50 mg/dL de glicemia. O sangue é coletado para medir os hormônios contrarreguladores quando a infusão de glicose e a glicose no sangue atingem um estado estacionário. Tanto as pinças hiperglicêmicas quanto as hipoglicêmicas têm o mesmo procedimento cirúrgico e montagens experimentais. Assim, este método é útil para pesquisadores do metabolismo sistêmico da glicose.

Introduction

A glicose é uma importante fonte de energia para as células, e a falta de glicose pode levar a uma variedade de sintomas e complicações. No caso de glicose baixa (hipoglicemia, geralmente inferior a 70 mg/dL no nível de glicemia de jejum, mas não deve ser determinada por um único valor¹), os sintomas mais comuns incluem fraqueza, confusão, sudorese e dor de cabeça. Também pode interromper a função cerebral e aumentar o risco de eventos cardiovasculares e mortalidade². Por outro lado, a hiperglicemia é uma condição médica na qual a concentração de glicose plasmática excede os níveis normais (geralmente > 126 mg/dL na glicemia de jejum³). Isso pode ocorrer em indivíduos com diabetes que têm um déficit na produção ou utilização de insulina. A hiperglicemia pode levar à cetoacidose diabética, que ocorre quando o corpo não pode usar a glicose para energia, mas em vez disso, quebra os ácidos graxos como combustível. O estado hiperosmolar hiperglicêmico também aumenta a mortalidade⁴. A hiperglicemia a longo prazo pode causar danos aos vasos sanguíneos, nervos e órgãos, levando ao desenvolvimento de várias complicações crônicas, como doenças cardiovasculares, retinopatias e doenças renais. Assim, a glicemia deve ser mantida em uma faixa restrita entre 100 mg/dL e 120 mg/dL.

A glicemia é regulada pelo balanço entre a entrada e a saída de glicose em um modelo unicompartimental (Figura 1A). A entrada de glicose inclui a glicose absorvida dos alimentos e a produção de glicose do fígado, rins e intestino delgado. O débito de glicose compreende a captação de glicose nos tecidos e a eliminação de glicose dos rins. Tanto a quantidade de entrada quanto a saída de glicose são reguladas por hormônios endócrinos. Por exemplo, glucagon, corticosterona e catecolaminas, conhecidas como hormônios contrarreguladores, são liberadas quando os níveis de glicose no sangue diminuem⁵. Eles estimulam a quebra de glicogênio e a síntese de glicose, principalmente a partir do fígado; Esses processos são conhecidos como glicogenólise e gliconeogênese, respectivamente. A hiperglicemia aumenta a liberação de insulina pelas células β pancreáticas e estimula a captação de glicose nos músculos, tecidos adiposos e coração 6,7,8,9. O exercício físico aumenta a captação de glicose insulino-independente¹⁰. O sistema nervoso simpático aumenta a captação de glicose nos músculos e no tecido adiposo marrom ^6,11. Para medir a capacidade de regular o metabolismo da glicose nos tecidos periféricos, os pesquisadores normalmente usam o teste de tolerância à glicose (GTT) e o teste de tolerância à insulina (ITT) (Figura 1B,C). No GTT, dois fatores devem ser considerados: liberação de insulina e sensibilidade à insulina (Figura 1B). No entanto, a curva de concentração de glicose durante o teste de 120 min é diferente em cada camundongo, o que pode afetar diferentes quantidades de liberação hormonal. No ITT, a glicose no sangue é regulada tanto pela sensibilidade à insulina quanto pela liberação de hormônios contrarreguladores. Portanto, é difícil determinar o significado preciso do metabolismo da glicose, liberação de insulina e sensibilidade à insulina no GTT e ITT, em situações em que os níveis de glicose no sangue não são constantes.

Para superar esses problemas, é desejável manter a glicose no sangue em um nível constante (ou “braçadeira”). No clamp hiperglicêmico, a glicose é infundida na corrente sanguínea para elevar os níveis de glicose no sangue para um nível específico e, em seguida, mantida nesse nível por um período de tempo. A quantidade de glicose infundida é ajustada com base em medições dos níveis de glicose no sangue a cada 5-10 minutos para manter um estado estacionário. Esta técnica é particularmente útil para a compreensão dos parâmetros de secreção de insulina em um nível de glicose clampeada. O clamp hipoglicêmico é um método para manter baixos níveis de glicose no sangue por infusão de insulina. A glicose é infundida a uma taxa variável para manter um nível específico de glicose no sangue. Se o rato não conseguir recuperar da hipoglicemia, deve ser infundida mais glicose.

Embora existam muitas vantagens na realização de pinças hiperglicêmicas e hipoglicêmicas, os procedimentos cirúrgicos e experimentais são considerados tecnicamente difíceis. Assim, poucos grupos de pesquisa conseguiram realizá-las. Nosso objetivo foi descrever esses métodos para que pesquisadores com restrições financeiras e de força de trabalho iniciem esses experimentos com um orçamento menor.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Kumamoto. NOTA: Para alívio da dor, o ibuprofeno foi administrado em água potável (0,11 mg/mL) por 48 h, e a buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg i.p.) foi administrada 30 minutos antes da cirurgia. As condições estéreis incluem luvas, máscaras e instrumentos autoclavados esterilizados com óxido de etileno entre os animais. A cirurgia foi realizada em uma almofada térmica …

Representative Results

O estudo do clamp hipoglicemiante foi realizado em camundongos machos C57BL/6N (8 semanas de idade, mais de 25 g PV) 3 h em jejum no início do experimento (Figura 4A,B). A glicemia inicial era de 136 mg/dL (t = -15 min). Se for inferior a 90 mg/dL, pode ser porque a cirurgia não correu bem, ou o cateter arterial foi inserido muito fundo, ou coágulos sanguíneos entraram no fluxo sanguíneo. A condição do rato após a cirurgia afeta o metabolismo energético no rato. O m…

Discussion

O método descrito aqui é simples e pode ser feito com pontas de pipetas, seringas e outros itens encontrados em laboratórios comuns. Embora os pesquisadores possam precisar comprar tubos e bombas adicionais, equipamentos caros não são necessários. Assim, esse protocolo de cateterismo e pinçamento é mais fácil de iniciar em comparação com relatos prévios 12,13,14.

A técnica de pinça foi d…

Materials

Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5